מתילן כחול ומיטוכונדריה: הובלת אלקטרונים והראיות

דמיינו שתי הכנות ניסוי זו לצד זו. שתיהן מכילות מיטוכונדריה מהמוח שהורעלו ברוטנון, חומר כימי החוסם את קומפלקס I בשרשרת הנשימה. לאחת מהן מוסיף החוקר בפיפטה מנה של מתילן כחול בריכוז מיקרומולרי. צריכת החמצן מתאוששת חלקית. מתח הממברנה חוזר חלקית. סינתזת ATP מתחדשת בהיקף קטן. בקיווטה הסמוכה, חיישן מי חמצן מספר את המחצית השנייה של הסיפור: ייצור מי החמצן גדל פי כמה, בכל מנה שנבדקה ובכל מצע שנוסה.

שתי המדידות נכונות. מתילן כחול הוא נשא אלקטרונים שיכול לשמור על זרימת אלקטרונים סביב מקטע פגום בשרשרת הנשימה, ואותו נשא גובה תוך כדי כך מחיר במי חמצן. כשמחזיקים בשתי העובדות יחד, הספרות על השפעת מתילן כחול על תפקוד המיטוכונדריה נעשית מובנת. כשמחזיקים רק באחת מהן, היא נראית כמו נס או כמו איום, בהתאם למאמר שפתחתם ראשון.

מנגנון העברת האלקטרונים, בפשטות

שרשרת הנשימה היא מסלול של העברה ממסר לממסר. אלקטרונים נכנסים דרך קומפלקס I (מ-NADH) או דרך קומפלקס II ואנזימי פלבין קשורים (מסוקצינאט ומתורמים דומים), עוברים דרך קומפלקס III אל הנשא הנייד ציטוכרום c, ואז דרך קומפלקס IV אל החמצן. כל העברה שואבת פרוטונים דרך הממברנה הפנימית, והמפל שנוצר מניע סינתזת ATP. חסימה של תחנה כלשהי משביתה את המסלול שלפניה.

מתילן כחול משתלב כשליח מקביל. צורתו המחומצנת קולטת אלקטרונים מנשאים במעלה השרשרת והופכת לצורה המחוזרת וחסרת הצבע, לויקומתילן כחול. זו מוסרת את האלקטרונים בהמשך השרשרת וחוזרת לצבע כחול. שתי הצורות מתוארות בהסבר על צמד החמצון־חיזור, והתנהגות ההעברה הרחבה יותר נידונה בהסבר על המנגנון הכללי. השאלה הפתוחה היא היכן השליח חוזר אל המסלול: בכיס הקישור לקינול של קומפלקס III, הידוע כאתר Qo, או ישירות בציטוכרום c. מסלול המסירה הדומיננטי תלוי בתנאים, כפי שמפורט בניתוח המעקף של קומפלקס III.

מה באמת מדדו שלושת המחקרים במכרסמים

כל שלושת המחקרים השתמשו במיטוכונדריה מבודדות מהמוח, כלומר באברונים שהוצאו מהתא והורחפו בתמיסת בופר מוגדרת. ללא תאים שלמים, ללא מתן החומר לבעלי חיים וללא נבדקים אנושיים. הריכוזים מתייחסים לתמיסה המקיפה את האברונים, לא למנה פומית לאדם. כששומרים על מסגרת זו, המספרים מדברים בבירור.

המחקר הראשון, שנערך במיטוכונדריה מבודדות ממוח של שרקן בריכוזים של 100 ננומולר עד 2 מיקרומולר, מיפה את התועלת ואת המחיר באותה הכנת ניסוי. במיטוכונדריה בריאות, הצבען העלה את צריכת החמצן במנוחה אך לא שינה את הנשימה המגורה על ידי ADP, ולכן תפוקת ה-ATP המצומדת לא השתפרה. תחת חסימת קומפלקס I, ריכוז של 2 מיקרומולר העלה את סינתזת ה-ATP מ-46 ל-93 ננומול לדקה למיליגרם, לעומת קצב תקין של כ-1109. תחת חסימת קומפלקס III, אותו ריכוז העלה את תפוקת ה-ATP מכ-46 ל-63, לעומת קצב תקין של כ-910. המתח וקליטת הסידן התאוששו חלקית. לא ניתן היה לעקוף חסימה של קומפלקס IV באמצעות ציאניד, מה שממקם את נקודת מסירת האלקטרונים המועילה לפני קומפלקס IV מתפקד. כל שחזור תפקוד היה מובהק סטטיסטית וקטן: אחוזים חד־ספרתיים מתפוקת ה-ATP התקינה.

המחקר השני, שנערך במיטוכונדריה מקליפת המוח של עכברים בריכוז של כ-1 מיקרומולר, אישר את המעקף של קומפלקס I והציב גבול בקומפלקס III. רוטנון הפחית את הנשימה מכ-121 לפחות מ-2 ננומול חמצן לדקה למיליגרם, והצבען העלה אותה לכ-21, בערך שישית מהערך התקין, בעוד שמתח הממברנה התאושש כמעט במלואו. אולם לאחר חסימת קומפלקס III, לא הנשימה ולא המתח התאוששו בטווח של 1 עד 5 מיקרומולר, והחסימה דיכאה את אות מי החמצן שמקורו בצבען. המחברים הציעו שהצבען המחוזר מוסר את האלקטרונים שלו באתר Qo של קומפלקס III: כאשר האתר תפוס, לשליח אין היכן למסור אותם.

המחקר השלישי, שנערך במיטוכונדריה ממוחות של עכברים, חולדות ושרקנים, בעיקר בריכוז של 2 מיקרומולר, בדק ישירות את המחלוקת ומצא שניתן לגשר על חסימה של קומפלקס III. כאשר מיקסותיאזול, מעכב אתר Qo, הפחית את הנשימה הבסיסית ב-88 אחוזים, הצבען החזיר את צריכת החמצן לכ-62 אחוזים מהקצב ללא חסימה. בבדיקה ישירה, חצי מיקרומולר חיזר ציטוכרום c ממקור חיצוני גם כאשר קומפלקס III היה חסום, ממצא התומך במסלול מ-NADH דרך הצבען אל ציטוכרום c ומשם אל קומפלקס IV. אבל הנשימה ששוחזרה התנהגה באופן חריג: הוספת ADP הפחיתה את צריכת החמצן במקום להעלות אותה, וחסימת סינתזת ATP הגבירה את הנשימה. הקיטוב של הממברנה שוחזר רק חלקית. צריכת חמצן גבוהה עם צימוד הפוך אינה ייצור אנרגיה תקין.

מדוע המעבדות אינן מסכימות, ומה מיישב את המחלוקת

ההסבר המבוסס על הבדלים בין מינים נפסל ראשון. הקבוצה השלישית חזרה על העבודה בשלושה מיני מכרסמים וקיבלה את אותו מעקף מבחינה איכותית בכולם, כולל בזן העכברים שבו דווח קודם שהמעקף נעדר. מה ששונה הוא הריכוז (1 לעומת 2 מיקרומולר), מינוני המעכבים, תמיסות הבופר, שיטות הבידוד, ומעל הכול המצב האנרגטי שהושווה: המעקף בולט ביותר לפני הוספת ADP, בדיוק במקום שבו מופיעה התגובה הפרדוקסלית ל-ADP. לכן תרשים נאמן לראיות מציג שתי נקודות מסירה התלויות בתנאים, אחת באתר Qo ואחת בציטוכרום c. השליח מוסר את המטען במקום שבו הכימיה המקומית מאפשרת לו לעשות זאת.

המחיר במי חמצן

הממצאים בצד המחיר עקביים כמו הממצאים בצד שחזור התפקוד. במחקר בשרקנים, הצבען העלה את שחרור מי החמצן בכל מצב שנבדק: במנוחה, בזמן סינתזת ATP ובמצב של פגיעה כימית, עם כל שלושת המצעים. במהלך סינתזת ATP, הייצור עלה מכ-148 ליותר מ-1500 פיקומול לדקה למיליגרם בריכוז של 1 מיקרומולר, ואפילו 100 ננומולר הגדילו את האות ביותר מפי ארבעה. הצבען גם האט את סילוק מי החמצן בערך פי 2.6, כך שהאות משקף יצירה מהירה יותר לצד סילוק איטי יותר. ההסבר הכימי המוצע הוא חיזור ישיר של חמצן על ידי הצבען המחוזר, ללא סופראוקסיד שניתן לזיהוי, אך זו עדיין פרשנות ולא שלב שהוכח.

המחקר בעכברים מסבך את התמונה באופן מועיל. ייצור מי החמצן עלה בחדות עם הריכוז, מערך בסיס של כ-76 לכמעט 2000 פיקומול לדקה למיליגרם בריכוז של 2 מיקרומולר, אך חסימת קומפלקס III דיכאה את הרכיב שמקורו בצבען. אילו מי החמצן נוצרו רק מתגובה של הצבען המחוזר עם חמצן, חסימת השרשרת לא הייתה אמורה להשפיע כל כך. היא כן משפיעה, ולכן השרשרת משתתפת בתהליך. הסקירה על פעילות נוגדת חמצון ומעודדת חמצון מציבה את הדואליות הזו בהקשר רחב יותר, והניתוח של חמצן לעומת ATP מסביר מדוע נתוני חמצן לבדם לעולם אינם מכריעים טענה בנוגע לאנרגיה.

שחזור תפקוד אינו תיקון

הביטוי שצריך להפסיק להשתמש בו הוא "האם מתילן כחול מתקן מיטוכונדריה". תיקון היה פירושו שיקום מתמשך: קומפלקסים שנבנו מחדש, צימוד שנשמר לאחר שהתרופה מתפנה, התאוששות בתאים שלמים, ולאחר מכן שיפור בתפקוד של אורגניזם חי. אף אחד משלושת המאמרים אינו מראה זאת. הם מראים ניתוב מחדש ומיידי באברונים שבודדו זה עתה, במהלך חסימה כימית מלאכותית, עם תפוקת ATP המהווה חלק קטן מהתפוקה התקינה ולעיתים עם צימוד משונה בעליל. רוטנון ואנטימיצין הם כלי מעבדה, לא מודלים להזדקנות או למחלות מיטוכונדריאליות בבני אדם, ושום דבר כאן אינו מתורגם ליותר אנרגיה אצל אדם בריא. זו שאלת ראיות נפרדת, עם ספרות מחקר משלה בבני אדם.

שלוש מגבלות שומרות על יושרה בכל מסקנה הנוגעת לביוהאקינג. ראשית, ריכוז בתמיסת הניסוי אינו מינון: 0.1 עד 2 מיקרומולר סביב אברונים מבודדים אינם מלמדים איזו כמות בנטילה פומית יוצרת את הריכוז החופשי הזה ליד מיטוכונדריה במוח אנושי, במיוחד משום שהצבען מצטבר או משתחרר בהתאם למתח הממברנה עצמו. שנית, חמצן אינו אנרגיה: הצבען יכול להעלות את צריכת החמצן באמצעות מחזורי תגובה ודליפה, ולא רק באמצעות זרחון יצרני, ולכן מדידת נשימה ללא מדידות ATP ומתח אינה מצדיקה טענה בנוגע לאנרגיה. שלישית, התועלת והמחיר שייכים לאותו משפט: כל אמירה על שחזור מתח או ATP שמשמיטה את העלייה הנלווית במי החמצן מציגה את הניסוי בצורה לא נאמנה. הסתייגויות קשורות כוללות את מאזן החמצון־חיזור של NAD, את צורת עקומת התגובה למינון ואת המדריך לבדיקות מעבדה.

הערה מעשית אחת: היכולת להעביר אלקטרונים היא תכונה של המולקולה המדויקת. תרכובות קרובות שנגרעו מהן קבוצות מתיל, כגון Azure B, פעילות גם הן בתגובות חמצון־חיזור, אך התנהגותן שונה. לכן תמיסה שהתפרקה חלקית מייצגת ניסוי שונה מצבען שלם. זו אחת הסיבות להתעקש על המפרט הפרמקופיאלי המלא ועל מסמך אצווה שפורסם, ולא על בדיקת מתכות בלבד. כימיה המונעת על ידי אור מוסיפה הסתייגות מקבילה לשימושים הכוללים הארה, הנידונה תחת שילובים עם אור אדום.

הטענה המצומצמת עומדת בכל ההסתייגויות האלה, וראוי לשמור עליה: מתילן כחול יכול לפעול, בתנאים מסוימים, כשליח אלקטרונים במיטוכונדריה מבודדות ופגועות, ולשמר חלקית את הזרימה במחיר של מי חמצן. כל מה שמעבר לכך, אנרגיה, אריכות ימים, תיקון, ממתין לראיות שהמחקרים האלה מעולם לא תוכננו לספק.