ההיסטוריה של מתילן כחול: מצבע לתרופה ולמחקר

מתילן כחול הגיע למטופל לפני שהגיע לבית מרקחת.

הדוח משנת 1891 מאת Paul Guttmann ו-Paul Ehrlich על השימוש בצבע במלריה כולל שני תרשימי טמפרטורה. השני משתרע מ-13 ביולי עד 5 באוגוסט, כשהטיפול מצוין לאורך השוליים יום אחר יום. ברישומים של 18 ו-19 ביולי נכתב "1 × 0,05 Methylenblau". בימים שלאחר מכן מופיעות חמש ושבע מנות באותה כמות, ועד 22 ביולי נוספה לרישום גם כמות קטנה של כינין. קו החום, שנע בין 37 °C ל-39.5 °C במחצית הראשונה של התרשים, משתטח לאחר הופעת הצבע ונשאר בין כ-36 °C ל-37.5 °C במשך שלושת השבועות הנותרים.

המטופל היה אחד משניים, שתוארו במאמר כמשרת בית וכמלח. החומר שקיבלו היה צבע טקסטיל מסחרי במשך חמש-עשרה שנה, ושני הגברים נמנים עם האנשים הראשונים שתועדו כמי שטופלו בתרופה סינתטית לחלוטין שנועדה לפעול כנגד אורגניזם מסוים.

הצבע הגיע קודם

הצבע הסינתטי הראשון שזכה להצלחה מסחרית נוצר בידי William Henry Perkin בשנת 1856. Perkin היה בן שמונה-עשרה, עבד במעבדה ביתית במהלך חופשת הפסחא וניסה לסנתז כינין. במקום זאת הוא קיבל משקע שחור, המיס אותו ומצא צבע שנקשר למשי בצורה מרשימה. הוא רשם עליו פטנט באוגוסט 1856, ועד סוף 1857 כבר הפעיל מפעל שסיפק צבע לבית צביעת משי בלונדון.

בשנת 1875 סינתז Adolf von Baeyer צבע אדום וקרא לו eosin, על שם Eos, המילה היוונית לשחר. בשנת 1876 Heinrich Caro, שהיה אז מנהל המעבדה ב-Badische Anilin- und Soda-Fabrik, פיתח יחד עם Baeyer את מתילן כחול כצבע מבוסס אנילין לכותנה. המבנה הכימי שלו לא הוכרע סופית אלא כעבור כתשע שנים.

המקור הזה עדיין ניכר באופן שבו החומר נקרא. "מתילן כחול" הוא שם מסחרי מקטלוג צבעים, לא תיאור כימי. התרכובת שאליה הוא מתייחס היא methylthioninium chloride, וההבדלים בין השם, המלח וההידרטים שלו נעשים חשובים ברגע ששוקלים את החומר או קוראים מפרט.

הצביעה הייתה הגשר

הדרך ממפעלי הצבע אל בית החולים עברה דרך המיקרוסקופ, והיא החלה עוד לפני שמתילן כחול היה קיים. Wilhelm Erb היה הראשון שהחיל צבע סינתטי על דם, באמצעות חומצה פיקרית בשנת 1865, וראה דפוס רטיקולרי בתוך חלק מתאי הדם האדומים.

עבודת הדוקטורט של Paul Ehrlich משנת 1878 השוותה בין צביעה היסטולוגית לבין צביעת טקסטיל וטענה ששני התהליכים הם תגובות כימיות. בעבודתו תחת Robert Koch על חיידק השחפת, הוא סיווג צבעי אנילין למחלקות חומציות ובסיסיות וקבע שכל מחלקה צובעת חלקים שונים של התא. בשנת 1880 הוא ערבב את שתי המחלקות: תמיסה רוויה של מתילן כחול שנמזגה לתוך acid fuchsin עד שהנוזל העליון התבהר. התוצאה, שאותה כינה neutralen Farbkörper או צבע ניטרלי, יצרה שלושה צבעים במקום אחד, חשפה גרנולות בתאים הפולימורפונוקלאריים שלא נראו קודם לכן, ואפשרה לראשונה ספירה מבדלת של לויקוציטים. מכיוון שהגרנולות האלה קלטו את שני מרכיבי התערובת, Ehrlich טבע את המונח neutrophil לתאים שנשאו אותן.

שנתיים לאחר מכן Koch השתמש במתילן כחול כדי לזהות את חיידק השחפת, וב-1883 Ehrlich שיפר את השיטה. בשנת 1886 הוא פרסם תצפית מסוג אחר: הוא הזריק את הצבע לבעלי חיים חיים והשווה את מידת קליטתו בכל איבר, והסיק שיש לו זיקה בולטת לרקמת מוח ועצבים. הוא ייחס את הזיקה הזו למחזור החמצון-חיזור של הצבע, שבו הבחין בשנה הקודמת. המחזור הזה הוא גם הסיבה לכך שתמיסת מתילן כחול מאבדת את צבעה כאשר החמצן שלה נצרך ומחזירה אותו כאשר האוויר שב. הניסויים שמדדו לראשונה את ההשלכות של המחזור הזה שייכים לעשור מאוחר יותר, והמנגנון עצמו הוא נושא נפרד מן ההיסטוריה.

הטפיל והגרעין הסגול

Alphonse Laveran מצא את טפיל המלריה בשנת 1880 באמצעות בדיקת דם טרי ולא צבוע. כדי לראות אותו באופן שגרתי במשטח מיובש נדרשה צביעה, והצבעים של אותה תקופה הפיקו רק אדום וכחול.

בשנת 1888 החליף הפתולוג הפולני Czesław Cheçinski את acid fuchsin ב-eosin, ויצר תערובת של מתילן כחול ו-eosin. המקרה שעליו התבססה השיטה שלו היה חייל שמת ממלריה ב-30 בספטמבר 1887. במשטחי הדם ראה Cheçinski צורות כחולות דמויות חרצית, המוכרות כיום כ-Plasmodium malariae, וצורות דמויות מגל, המוכרות כיום כגמטוציטים של Plasmodium falciparum. התוצאה סיימה בבת אחת את המחלוקת סביב שני הסברים מתחרים למחלה: תאוריית המיאזמה, והטענה של Edwin Klebs ו-Corrado Tommasi-Crudeli שמלריה נגרמת על ידי חיידק.

הטפיל היה נראה לעין. הגרעין שלו לא היה נראה, ולכן טבעו נותר פתוח לשאלה. Ernst Malachowski, רופא ב-Breslau, פתר את הבעיה במקרה ולאחר מכן במכוון. בשנת 1889 הוא הבחין בצביעה מבדלת של גרעין הפלסמודיום בתכשיר, אך לא הצליח לשחזר אותה. החמצת מתילן כחול לא עזרה. הבססתו באמצעות borax יצרה את האפקט בכל פעם. הוא הדגים את הטכניקה בפומבי ב-15 ביוני 1890 ופרסם אותה באותה שנה, עם שיטה מפורטת יותר באוגוסט 1891.

Dmitri Romanowsky פרסם גרסה משלו בספטמבר 1891. התוצאות הטובות ביותר שלו התקבלו מבקבוק מוזנח ועבש של תמיסת מתילן כחול שהיה בן יותר מחודשיים. התיאור של Malachowski היה מכוון, ולדבריו ניתן לשחזור בקלות; זה של Romanowsky היה מבוי סתום שעבד פעם אחת. אף על פי כן, האפונים נקשר דווקא ל-Romanowsky, והמחלוקת בשאלה מי יצר את הצבע הסגול שהפך את הגרעין לנראה היא סיפור נפרד עם מסמכים משלו.

איור: תרשים הטמפרטורה השני מהדוח של Guttmann ו-Ehrlich משנת 1891. הלוח העליון מכסה את 13 עד 24 ביולי והלוח התחתון את 25 ביולי עד 5 באוגוסט; הרישומים בשוליים מציינים את המנות שניתנו, והטמפרטורה נשארת קרובה לטווח התקין במשך שלושת השבועות האחרונים של הרישום. משוחזר מתוך הדוח כפי שנסרק עבור Krafts, Hempelmann ו-Skórska-Stania, Parasitology Research 111:1–6 (2012), PMID 22411634.

התברר שה"הבשלה" הייתה דה-מתילציה

איש מהמעורבים בשנות ה-1890 לא ידע מה עושה "הבשלה" למתילן כחול. התשובה הגיעה מן הכימיה התעשייתית. Heinrich August Bernthsen סינתז בשנת 1883 את תרכובת האם phenothiazine, קבע בשנת 1885 שמתילן כחול שייך למשפחה הזו, ובאותה תקופה הראה שתנאים בסיסיים מסירים קבוצות מתיל מן הצבע ויוצרים את התרכובות המכונות כיום azures.

Bernard Nocht הפריד את החלק הפעיל ב-1898 וב-1899 ויכול היה לכנות אותו רק Rot aus Methylenblau, אדום ממתילן כחול. Michaelis זיהה אותו כ-azure I בשנת 1901. Jenner הכניס ב-1899 שימוש במתנול מוחלט כממס למשקע הצבע, וכך ביטל את הצורך בקיבוע משטחי דם בחום; Leishman ו-Reuter שילבו את שני החידושים; Wright פרסם שיטה מפושטת ב-1902. תרומתו של Giemsa, גם היא ב-1902, הייתה להפסיק להסתמך על תמיסה שעברה הבשלה אקראית ולהשתמש במקום זאת בכמויות מדודות של צבעים ידועים. לאחר מכן הוא סירב לפרסם כיצד הפיק methylene azure טהור ומכר את השיטה למעבדה של Dr. Grübler, ששיווקה את המוצר כ-azure I וטענה שרק הגרסה שלה היא צביעת Giemsa אותנטית.

שתי מלחמות עולם השלימו את התהליך במקרה. כאשר לא ניתן היה להשיג צבעים גרמניים, Lillie, Roe ו-Wilcox עבדו על תחליפים אמריקאיים וגילו שהצביעה הטובה ביותר התקבלה משלושה מרכיבים נפרדים: מתילן כחול טהור, תוצר הפירוק שלו Azure B, ו-eosin. שלושתם נשארו המרכיבים העיקריים של הצביעה המשמשת כיום לאבחון מלריה, תחת שם שמחבר כעת את Malachowski, Wright ו-Giemsa.

איור: צורות טבעת של Plasmodium falciparum בתאי דם אדומים אנושיים, שנצבעו בשיטה מסוג Romanowsky. המבנה הסגול בתוך הטבעת הוא הכרומטין שמתילן כחול שטופל ב-borax בשיטתו של Malachowski הפך לנראה לראשונה. תמונה מאת Ernst Hempelmann, שוחררה לנחלת הכלל.

שם אחד, כמה חומרים

השנים שבהן הופרדו המרכיבים האלה זו מזה הותירו בעיה שהאריכה ימים מעבר לכימיה עצמה. Ralph Lillie הבחין בשנת 1969 בין צבעים ביולוגיים, "המיוצרים לפי מפרטים נוקשים התואמים את השימושים העדינים והתובעניים שלהם", לבין צבעים לא-ביולוגיים לצביעת טקסטיל, אשר "דורשים תקני ייצור פחות קפדניים ותובעניים". שני סוגי המוצרים נשאו את אותו שם, וההבדל ביניהם מעולם לא היה רק הבדל בדרגה. מפרט שנכתב עבור כותנה ומפרט שנכתב עבור ריאגנט אבחוני אינם ניתנים להחלפה, וחומר שיוצר לפי מפרט טקסטיל לא נועד לבליעה.

Azure B הוא ההמחשה הברורה ביותר. זוהי הצורה המונודה-מתילטית של מתילן כחול, יש לה פעילות פרמקולוגית מדידה משל עצמה, והיא הייתה קיימת כמרכיב בלתי מבוקר בתכשירים קליניים של מתילן כחול במשך יותר ממאה שנה לפני שמישהו הפריד בין השניים. קבוצה אחת מצאה שרקמה אנושית שנדגמה בנתיחה לאחר מתן מתילן כחול הכילה 5 עד 14 אחוז מתילן כחול ללא שינוי ו-86 עד 95 אחוז Azure B. השאלה אם תכשיר מסוים אמור להכיל Azure B, ובאיזו מגבלה, היא שאלת מפרט, והמחקר על Azure B כזיהום וכמטבוליט ממשיך משם.

המפרט הוא גם המקום שבו נמצאת המשמעות המעשית. עמידה בדרישות USP היא הדרך לרמת הטוהר הגבוהה ביותר שהשוק מציע, משום שמדובר בתקן בדיקה מלא שפורסם ולא במדידה יחידה. הוא כולל זהות, assay, זיהומים אורגניים כולל צבעי azure, ממסים שאריתיים, זיהומים יסודיים, שארית לאחר שריפה, מגבלות מיקרוביאליות ואנדוטוקסינים חיידקיים. תעודה שמדווחת על תוצאת מתכות כבדות ומכנה אותה עמידה ב-USP דיווחה על שורה אחת בלבד מתוך הרשימה הזו.

Blupreme משיגה את המתילן הכחול שלה מיצרן תרופות ומפרסמת את תעודת האנליזה המלאה, תוך בדיקת מפרט USP כולו ולא רק מתכות כבדות. המדריך לקריאת תעודת אנליזה ומה סימון USP כן ולא מוכיח מסבירים כיצד לבדוק את המסמך מול הטענה.

מה ההיסטוריה מאפשרת להסיק, ומה לא

השושלת ההיסטורית אמיתית, והיא ארוכה יותר מכפי שרוב דפי המוצר מרמזים. מתילן כחול שימש לטיפול במלריה בשנת 1891, דווח כחומר מרגיע בפסיכוזה אגיטטיבית בשנת 1899, והשרשרת הצדדית שלו עוברת דרך quinacrine, chloroquine, promethazine ו-chlorpromazine. המאמר של Ehrlich משנת 1890 עם Arthur Leppmann תיאר הקלה בכאב נוירלגי וראומטי, ולאחר מכן שקל את השימוש בצבע במחלות נפש והחליט שלא לבדוק אותו לכך.

שום דבר מזה אינו מבסס שימוש מודרני. התוצאה במלריה בשנת 1891 התבססה על שני מטופלים ותרשים טמפרטורה. היכרות ממושכת עם מולקולה היא סיבה לחקור אותה, לא תוצאה מחקרית. ההיסטוריה של התרכובת כתרופה והניסויים המודרניים במלריה עונים על שאלות שונות מאלה ש-Ehrlich שאל, ויש לקרוא את מדדי התוצאה בהתאם להקשר שלהם.

יש פרט אחד ברשומה ששייך להווה ולא לעבר. כאשר חוקרים ערכו ניסויים במתילן כחול נגד מלריה בבורקינה פאסו בשנות ה-2000, הם מצאו את עצמם מתחרים על חומר בדרגת איכות פרמצבטית, ודיווחו שמחיר חומר הגלם עלה בערך פי מאה לאחר שקיבל אימות GMP. אפשר היה להחליף צבע. אי אפשר היה להחליף תרופה. ההבחנה ש-Lillie ניסח בשנת 1969 היא אותה הבחנה שקובעת מה מכיל בקבוק כיום.