Metilensko plavo i mitohondrije: transport elektrona i dokazi

Zamislite dva preparata jedan pored drugog. Oba sadrže mitohondrije mozga izložene rotenonu, hemikaliji koja blokira kompleks I respiratornog lanca. U jedan preparat istraživač pipetom dodaje metilensko plavo u mikromolarnoj koncentraciji. Potrošnja kiseonika delimično se oporavlja. Membranski potencijal delimično se vraća. Ponovo počinje sinteza male količine ATP-a. U susednoj kiveti senzor za peroksid otkriva drugu polovinu priče: stvaranje vodonik-peroksida povećalo se nekoliko puta, pri svakoj ispitanoj koncentraciji i sa svakim isprobanim supstratom.

Oba očitavanja su tačna. Metilensko plavo je prenosilac elektrona koji može da održava njihov tok zaobilazeći oštećeni deo respiratornog lanca, a isti taj prenosilac pritom naplaćuje cenu u vidu peroksida. Kada se obe činjenice uzmu u obzir istovremeno, literatura o uticaju metilenskog plavog na mitohondrijsku funkciju postaje razumljiva. Ako se uzme u obzir samo jedna, deluje kao priča o čudu ili opasnosti, zavisno od toga koji ste rad prvi otvorili.

Prenos elektrona, jednostavno objašnjen

Respiratorni lanac je niz uzastopnih prenosa. Elektroni ulaze preko kompleksa I (iz NADH) ili preko kompleksa II i srodnih flavinskih enzima (iz sukcinata i sličnih donora), prolaze kroz kompleks III do pokretnog prenosioca citohroma c, a zatim kroz kompleks IV do kiseonika. Svaka predaja elektrona pumpa protone preko unutrašnje membrane, a nastali gradijent pokreće sintezu ATP-a. Blokirajte bilo koju stanicu i tok uzvodno od nje staje.

Metilensko plavo uključuje se kao paralelni kurir. Njegov oksidovani oblik preuzima elektrone od uzvodnih prenosilaca i prelazi u bezbojni redukovani oblik, leukometilensko plavo, koji zatim predaje te elektrone nizvodno i ponovo postaje plav. Ova dva oblika opisana su u objašnjenju redoks para, a šire ponašanje pri prenosu obrađeno je u opštem objašnjenju mehanizma. Otvoreno pitanje je gde se kurir ponovo uključuje u lanac: u džepu za vezivanje hinola u kompleksu III, poznatom kao Qo mesto, ili direktno na citohromu c. Koji izlaz dominira zavisi od uslova, što je detaljno prikazano u analizi zaobilaženja kompleksa III.

Šta su tri studije na glodarima zaista merile

Sve tri studije koristile su izolovane mitohondrije mozga, odnosno organele izdvojene iz ćelije i suspendovane u puferu definisanog sastava. Nije bilo celih ćelija, životinja kojima je davana supstanca niti ljudskih ispitanika. Koncentracije se odnose na rastvor oko organela, a ne na oralnu dozu za čoveka. Ako se taj okvir dosledno zadrži, brojevi govore jasno.

Prva studija, sprovedena na izolovanim mitohondrijama mozga zamorca pri koncentracijama od 100 nanomolarnih do 2 mikromolarne, prikazala je korist i cenu u istom preparatu. U zdravim mitohondrijama boja je povećala potrošnju kiseonika u stanju mirovanja, ali nije promenila respiraciju stimulisanu ADP-om, pa se spregnuta proizvodnja ATP-a nije poboljšala. Pri blokadi kompleksa I, koncentracija od 2 mikromolarne povećala je sintezu ATP-a sa 46 na 93 nanomola u minuti po miligramu, naspram normalne stope od približno 1109. Pri blokadi kompleksa III, ista koncentracija povećala je sintezu ATP-a sa približno 46 na 63, naspram normalne stope od približno 910. Membranski potencijal i preuzimanje kalcijuma delimično su se oporavili. Blokada kompleksa IV cijanidom nije mogla da se zaobiđe, što smešta koristan izlaz elektrona uzvodno od funkcionalnog kompleksa IV. Svako obnavljanje funkcije bilo je statistički potvrđeno i malo: jednocifreni procenti normalne proizvodnje ATP-a.

Druga studija, sprovedena na mitohondrijama kore mozga miša pri koncentraciji od približno 1 mikromolarne, potvrdila je zaobilaženje kompleksa I i postavila granicu kod kompleksa III. Rotenon je smanjio respiraciju sa približno 121 na manje od 2 nanomola kiseonika u minuti po miligramu, a boja ju je povećala na približno 21, otprilike šestinu normalne vrednosti, dok se membranski potencijal gotovo potpuno oporavio. Međutim, nakon blokade kompleksa III, ni respiracija ni potencijal nisu se oporavili pri koncentracijama od 1 do 5 mikromolarnih, a blokada je potisnula peroksidni signal izazvan bojom. Autori su predložili da redukovana boja predaje svoje elektrone na Qo mestu kompleksa III: kada je to mesto zauzeto, kurir nema gde da ih preda.

Treća studija, sprovedena na mitohondrijama mozga miša, pacova i zamorca uglavnom pri koncentraciji od 2 mikromolarne, direktno je ispitala ovo neslaganje i utvrdila da se blokada kompleksa III može premostiti. Kada je miksotiazol, inhibitor Qo mesta, smanjio bazalnu respiraciju za 88 procenata, boja je vratila potrošnju kiseonika na približno 62 procenta stope bez blokade. U direktnom testu, boja je pri koncentraciji od pola mikromolarne redukovala egzogeni citohrom c čak i dok je kompleks III bio blokiran, što podržava put od NADH preko boje do citohroma c i dalje do kompleksa IV. Ali obnovljena respiracija ponašala se nenormalno: dodati ADP smanjio je potrošnju kiseonika umesto da je poveća, a blokiranje sinteze ATP-a stimulisalo je respiraciju. Membranski potencijal se samo delimično repolarizovao. Velika potrošnja kiseonika uz obrnuto sprezanje nije normalna proizvodnja energije.

Zašto se laboratorije ne slažu i šta razrešava neslaganje

Objašnjenje zasnovano na razlikama među vrstama prvo otpada. Treća grupa ponovila je eksperimente kod tri vrste glodara i u svima dobila kvalitativno isto zaobilaženje, uključujući i soj miša kod kojeg je prethodno prijavljeno odsustvo zaobilaženja. Umesto toga, razlikuju se koncentracija (1 naspram 2 mikromolarne), doze inhibitora, puferi, metode izolacije i, pre svega, energetsko stanje koje se poredi: zaobilaženje je najjasnije pre dodavanja ADP-a, upravo tamo gde se pojavljuje paradoksalan odgovor na ADP. Zato veran dijagram prikazuje dva izlaza zavisna od uslova, jedan na Qo mestu i drugi na citohromu c. Kurir predaje elektrone tamo gde mu lokalni hemijski uslovi to dopuštaju.

Cena u vidu peroksida

Nalazi o ceni jednako su dosledni kao nalazi o obnavljanju funkcije. U radu na zamorcima boja je povećala oslobađanje peroksida u svim ispitanim uslovima: u mirovanju, tokom sinteze ATP-a i pri hemijskom oštećenju, sa sva tri supstrata. Tokom sinteze ATP-a, stvaranje peroksida poraslo je sa približno 148 na više od 1500 pikomola u minuti po miligramu pri koncentraciji od 1 mikromolarne, a čak je i koncentracija od 100 nanomolarnih više nego učetvorostručila signal. Boja je takođe usporila uklanjanje peroksida približno 2.6 puta, pa signal odražava i brže stvaranje i sporije uklanjanje. Predloženi hemijski mehanizam jeste direktna redukcija kiseonika redukovanom bojom bez detektabilnog superoksida, mada to ostaje tumačenje, a ne dokazan korak.

Rad na miševima dodatno usložnjava sliku na koristan način. Peroksid je naglo rastao sa koncentracijom, sa početne vrednosti od približno 76 na gotovo 2000 pikomola u minuti po miligramu pri koncentraciji od 2 mikromolarne, ali je blokada kompleksa III potisnula komponentu izazvanu bojom. Kada bi peroksid nastajao samo reakcijom redukovane boje sa kiseonikom, blokiranje lanca ne bi trebalo da ima toliki uticaj. Uticaj ipak postoji, što znači da lanac učestvuje. Pregled antioksidativnog i prooksidativnog delovanja smešta ovu dvojnost u širi kontekst, a analiza kiseonika naspram ATP-a objašnjava zašto podaci o kiseoniku sami po sebi nikada ne razrešavaju tvrdnju o energiji.

Obnavljanje funkcije nije popravka

Pitanje koje treba prestati postavljati glasi: „Da li metilensko plavo popravlja mitohondrije?“ Popravka bi značila trajno ispravljanje: obnovljene komplekse, sprezanje koje opstaje nakon uklanjanja supstance, oporavak u celim ćelijama, a zatim i poboljšanu funkciju u živom organizmu. Nijedan od tri rada to ne pokazuje. Oni pokazuju akutno preusmeravanje u sveže izolovanim organelama tokom veštačke hemijske blokade, uz proizvodnju ATP-a koja predstavlja mali deo normalne i ponekad izrazito neobično sprezanje. Rotenon i antimicin su laboratorijski alati, a ne modeli starenja ili mitohondrijskih bolesti kod ljudi, i ništa od ovoga ne znači više energije za zdravu osobu, što je zasebno pitanje dokaza sa sopstvenom literaturom o istraživanjima na ljudima.

Tri ograničenja čuvaju utemeljenost svakog zaključka o biohakovanju. Prvo, koncentracija u rastvoru nije doza: 0.1 do 2 mikromolarne oko izolovanih organela ne govori ništa o tome koja oralna količina stvara tu koncentraciju slobodne supstance kod mitohondrije ljudskog mozga, naročito zato što se boja akumulira ili oslobađa u zavisnosti od samog membranskog potencijala. Drugo, kiseonik nije energija: boja može da poveća potrošnju kiseonika kroz kruženje i curenje elektrona, kao i kroz produktivnu fosforilaciju, pa respirometrija bez merenja ATP-a i potencijala ne može da opravda tvrdnju o energiji. Treće, korist i opterećenje pripadaju istoj rečenici: svaka izjava o obnovljenom potencijalu ili ATP-u koja izostavlja istovremeni porast peroksida pogrešno prikazuje eksperiment. Povezana ograničenja uključuju redoks ravnotežu NAD, oblik odnosa doze i odgovora i vodič za izbor testova.

Jedna praktična napomena: sposobnost prenosa elektrona svojstvo je tačno određenog molekula. Demetilovani srodnici poput Azure B takođe su redoks aktivni, ali se ponašaju drugačije, pa je delimično razgrađen rastvor drugačiji eksperiment od onog sa nerazgrađenom bojom. To je jedan od razloga da se insistira na punoj farmakopejskoj specifikaciji i objavljenom dokumentu za seriju, umesto samo na ispitivanju metala. Hemijske reakcije pokrenute svetlošću donose dodatno ograničenje pri primenama uz osvetljavanje, obrađeno u tekstu o kombinacijama sa crvenom svetlošću.

Usko postavljena tvrdnja ostaje održiva uprkos svemu ovome i vredi je zadržati: metilensko plavo može, pod određenim uslovima, da deluje kao kurir elektrona u oštećenim izolovanim mitohondrijama, delimično održavajući tok uz cenu u vidu peroksida. Sve izvan toga — energija, dugovečnost, popravka — čeka dokaze koje ove studije nikada nisu bile osmišljene da pruže.