Istorija metilenskog plavog: od boje do leka i istraživanja

Metilensko plavo stiglo je do pacijenta pre nego što je stiglo do apoteke.

Izveštaj Paula Guttmanna i Paula Ehrlicha iz 1891. o upotrebi ove boje kod malarije sadrži dva grafikona temperature. Drugi obuhvata period od 13. jula do 5. avgusta, sa tretmanom upisanim duž margine iz dana u dan. Unosi za 18. i 19. jul glase „1 × 0,05 Methylenblau“. Narednih dana navedeno je pet i sedam doza iste količine, a do 22. jula u zapis je dodata i mala količina kinina. Linija temperature, koja u prvoj polovini grafikona oscilira između 37 °C i 39.5 °C, izravnava se nakon pojave boje i ostaje između približno 36 °C i 37.5 °C tokom preostale tri nedelje.

Pacijent je bio jedan od dvojice, opisanih u radu kao kućni sluga i mornar. Jedinjenje koje su primili petnaest godina je bilo komercijalna tekstilna boja, a ta dvojica muškaraca spadaju među prve zabeležene ljude lečene potpuno sintetičkim lekom usmerenim na određeni organizam.

Boja je bila prva

Prvu komercijalno uspešnu sintetičku boju napravio je William Henry Perkin 1856. Perkin je imao osamnaest godina, radio je u kućnoj laboratoriji tokom uskršnjeg raspusta i pokušavao da sintetiše kinin. Umesto toga dobio je crni ostatak, rastvorio ga i otkrio boju koja se izuzetno dobro vezivala za svilu. Patentirao ju je u avgustu 1856, a do kraja 1857. imao je fabriku koja je snabdevala jednu londonsku bojadisaonicu svile.

Adolf von Baeyer je 1875. sintetisao crvenu boju i nazvao je eozin, prema Eos, grčkoj reči za zoru. Heinrich Caro, tada direktor laboratorije kompanije Badische Anilin- und Soda-Fabrik, razvio je 1876. metilensko plavo zajedno sa Baeyerom kao boju na bazi anilina za pamuk. Njegova hemijska struktura nije konačno utvrđena sve do otprilike devet godina kasnije.

To poreklo i dalje je vidljivo u načinu na koji se supstanca naziva. „Methylene blue“ je trgovački naziv iz kataloga boja, a ne hemijski opis. Jedinjenje na koje se naziv odnosi jeste metiltioninijum-hlorid, a razlike između naziva, soli i njenih hidrata postaju važne čim neko meri masu materijala ili čita specifikaciju.

Bojenje je bilo most

Put od fabrike boja do bolnice vodio je kroz mikroskop, a počeo je pre nego što je metilensko plavo postojalo. Wilhelm Erb je bio prva osoba koja je primenila sintetičku boju na krv, koristeći pikrinsku kiselinu 1865, i uočio je mrežasti obrazac unutar nekih crvenih krvnih zrnaca.

Doktorska teza Paula Ehrlicha iz 1878. upoređivala je histološko bojenje sa bojenjem tekstila i tvrdila da su oba procesa hemijske reakcije. Radeći pod Robertom Kochom na bacilu tuberkuloze, razvrstao je anilinske boje u kisele i bazne klase i utvrdio da svaka klasa boji različite delove ćelije. Godine 1880. pomešao je te dve vrste: zasićeni rastvor metilenskog plavog sipan je u kiseli fuksin dok se supernatant nije razbistrio. Rezultat, koji je nazvao neutralen Farbkörper ili neutralna boja, dao je tri boje umesto jedne, otkrio granule u polimorfonuklearnim ćelijama koje ranije nisu bile vidljive i omogućio prvi diferencijalni broj leukocita. Pošto su te granule primale obe komponente smeše, Ehrlich je skovao reč neutrofil za ćelije koje ih nose.

Dve godine kasnije Koch je koristio metilensko plavo da pronađe bacil tuberkuloze, a Ehrlich je 1883. unapredio metodu. Godine 1886. objavio je drugačiju vrstu zapažanja: ubrizgao je boju živim životinjama i uporedio koliko je snažno svaki organ preuzima, zaključivši da ima izražen afinitet prema mozgu i nervnom tkivu. Taj afinitet pripisao je oksidaciono-redukcionom ciklusu boje, koji je uočio prethodne godine. Taj ciklus je i razlog zbog kojeg rastvor metilenskog plavog gubi boju kada se njegov kiseonik potroši i ponovo je dobija kada se vazduh vrati. Eksperimenti koji su prvi izmerili posledice tog ciklusa pripadaju kasnijoj deceniji, a sam mehanizam je zasebna tema u odnosu na istoriju.

Parazit i ljubičasto jedro

Alphonse Laveran pronašao je parazita malarije 1880. pregledajući svežu, neobojenu krv. Da bi se redovno uočavao u osušenom razmazu bila je potrebna boja, a tadašnje metode bojenja davale su samo crvenu i plavu.

Poljski patolog Czesław Cheçinski je 1888. zamenio kiseli fuksin eozinom, stvarajući smešu metilenskog plavog i eozina. Slučaj na kojem je zasnovao svoju metodu bio je vojnik koji je umro od malarije 30. septembra 1887. U krvnim razmazima Cheçinski je video plave oblike nalik beloj radi, danas prepoznate kao Plasmodium malariae, i srpaste oblike, danas prepoznate kao gametociti Plasmodium falciparum. Rezultat je istovremeno okončao dva konkurentska objašnjenja bolesti: teoriju mijazme i tvrdnju Edwina Klebsa i Corrada Tommasi-Crudelija da malariju izaziva bakterija.

Parazit je bio vidljiv. Njegovo jedro nije, pa je njegova priroda ostala otvoreno pitanje. Ernst Malachowski, lekar u Breslauu, rešio je taj problem prvo slučajno, a zatim namerno. Godine 1889. primetio je diferencijalno bojenje plazmodijumskog jedra u jednom preparatu i nije uspeo da ga ponovi. Zakiseljavanje metilenskog plavog nije pomoglo. Alkalizovanje boraksom davalo je efekat svaki put. Tehniku je javno demonstrirao 15. juna 1890. i objavio je iste godine, uz detaljniju metodu u avgustu 1891.

Dmitri Romanowsky objavio je sopstvenu verziju u septembru 1891. Najbolje rezultate dobio je iz zanemarene, plesnive boce rastvora metilenskog plavog stare više od dva meseca. Malachowskijev opis bio je nameran i, prema njegovim rečima, lako ponovljiv; Romanowskyjev je bio slepa ulica koja je proradila jednom. Eponim je ipak pripao Romanowskom, a spor oko toga ko je dobio ljubičastu boju koja je učinila jedro vidljivim zasebna je priča sa sopstvenim dokumentima.

Slika: drugi grafikon temperature iz izveštaja Guttmanna i Ehrlicha iz 1891. Gornji panel obuhvata period od 13. do 24. jula, a donji od 25. jula do 5. avgusta; unosi na margini navode primenjene doze, a temperatura ostaje blizu normalne tokom poslednje tri nedelje zapisa. Reprodukovano iz izveštaja skeniranog za Kraftsa, Hempelmanna i Skórsku-Staniu, Parasitology Research 111:1–6 (2012), PMID 22411634.

Pokazalo se da je sazrevanje demetilacija

Niko ko je učestvovao tokom 1890-ih nije znao šta „sazrevanje“ radi metilenskom plavom. Odgovor je došao iz industrijske hemije. Heinrich August Bernthsen je 1883. sintetisao matično jedinjenje fenotiazin, 1885. utvrdio da metilensko plavo pripada toj porodici i u istom periodu pokazao da alkalni uslovi uklanjaju metil grupe iz boje, stvarajući jedinjenja koja se danas nazivaju azurima.

Bernard Nocht je 1898. i 1899. izdvojio aktivnu frakciju i mogao je samo da je nazove Rot aus Methylenblau, crveno iz metilenskog plavog. Michaelis ju je 1901. identifikovao kao azur I. Jenner je 1899. uveo apsolutni metanol kao rastvarač za talog boje, čime je uklonjena potreba za toplotnom fiksacijom krvnih razmaza; Leishman i Reuter spojili su oba unapređenja; Wright je 1902. objavio pojednostavljenu metodu. Giemsin doprinos, takođe iz 1902, bio je da prestane da se oslanja na nasumično sazreo rastvor i umesto toga koristi izmerene količine poznatih boja. Zatim je odbio da objavi kako pravi čisti metilenski azur i prodao je metodu laboratoriji Dr. Grübler, koja je proizvod stavila na tržište kao azur I i tvrdila da je samo njena verzija autentična Giemsa boja.

Dva svetska rata slučajno su dovršila posao. Kada su nemačke boje postale nedostupne, Lillie, Roe i Wilcox radili su na američkim zamenama i ustanovili da se najbolje bojenje dobija pomoću tri odvojene komponente: čistog metilenskog plavog, njegovog produkta razgradnje azure B, i eozina. Te tri supstance i danas ostaju glavne komponente boje koja se koristi za dijagnostikovanje malarije, pod nazivom koji sada zajedno obuhvata Malachowskog, Wrighta i Giemsu.

Slika: prstenasti oblici Plasmodium falciparum u ljudskim crvenim krvnim zrncima, obojeni metodom tipa Romanowsky. Ljubičasta struktura unutar prstena jeste hromatin koji je metilensko plavo tretirano Malachowskijevim boraksom prvi put učinilo vidljivim. Slika: Ernst Hempelmann, puštena u javni domen.

Jedno ime, više materijala

Godine tokom kojih su te komponente razdvajane ostavile su problem koji je nadživeo samu hemiju. Ralph Lillie je 1969. povukao granicu između bioloških boja, „proizvedenih prema strogim specifikacijama primerenim njihovoj osetljivoj i zahtevnoj upotrebi“, i nebioloških boja za bojenje tekstila, koje „zahtevaju manje stroge i manje zahtevne proizvodne standarde“. Obe vrste proizvoda nosile su isto ime, a razlika između njih nikada nije bila samo razlika u stepenu. Specifikacija napisana za pamuk i specifikacija napisana za dijagnostički reagens nisu međusobno zamenljive, a materijal napravljen prema tekstilnoj specifikaciji nije bio namenjen gutanju.

Azure B je najjasniji primer. To je monodemetilovani oblik metilenskog plavog, ima sopstvenu merljivu farmakološku aktivnost i bio je prisutan kao nekontrolisani sastojak kliničkih preparata metilenskog plavog više od jednog veka pre nego što je iko razdvojio ta dva jedinjenja. Jedna grupa je utvrdila da je ljudsko tkivo uzorkovano tokom autopsije nakon primene metilenskog plavog sadržalo 5 do 14 procenata nepromenjenog metilenskog plavog i 86 do 95 procenata azure B. Da li određeni preparat treba da sadrži azure B i u kojoj granici pitanje je specifikacije, a istraživanje azure B kao nečistoće i metabolita nastavlja odatle.

Specifikacija je takođe mesto gde se nalazi praktična posledica. Usklađenost sa USP predstavlja put do najviše čistoće koju tržište nudi, jer je to kompletan objavljeni standard ispitivanja, a ne jedno merenje. Obuhvata identitet, sadržaj aktivne supstance, organske nečistoće uključujući azurne boje, rezidualne rastvarače, elementarne nečistoće, ostatak nakon žarenja, mikrobiološke granice i bakterijske endotoksine. Sertifikat koji navodi rezultat za teške metale i naziva ga usklađenošću sa USP prijavio je samo jednu stavku sa te liste.

Blupreme nabavlja svoje metilensko plavo od farmaceutskog proizvođača i objavljuje kompletan sertifikat analize, ispitujući čitavu USP specifikaciju, a ne samo teške metale. Vodič za čitanje sertifikata analize i šta oznaka USP utvrđuje, a šta ne objašnjavaju kako dokument proveriti u odnosu na tvrdnju.

Šta istorija opravdava, a šta ne

Poreklo je stvarno i duže je nego što većina stranica proizvoda sugeriše. Metilensko plavo korišćeno je za lečenje malarije 1891, prijavljeno je kao sedativ kod uznemirene psihoze 1899, a njegova bočna grana vodi kroz kvinakrin, hlorokin, prometazin i hlorpromazin. Ehrlichov rad iz 1890. sa Arthurom Leppmannom opisao je ublažavanje neuralgičnog i reumatskog bola, a zatim razmotrio i odbacio ispitivanje boje kod mentalnih bolesti.

Ništa od toga ne uspostavlja savremenu primenu. Rezultat kod malarije iz 1891. zasnivao se na dva pacijenta i grafikonu temperature. Dugotrajna poznatost molekula razlog je da se on proučava, a ne rezultat. Istorija jedinjenja kao leka i savremena ispitivanja kod malarije odgovaraju na drugačija pitanja od onih koja je Ehrlich postavljao, a ishodi moraju da se tumače u sopstvenom kontekstu.

U zapisu postoji jedan detalj koji pripada sadašnjosti, a ne prošlosti. Kada su istraživači tokom 2000-ih sprovodili ispitivanja metilenskog plavog kod malarije u Burkini Faso, našli su se u konkurenciji za materijal farmaceutskog kvaliteta i izvestili da je cena sirovine porasla za faktor od približno sto kada je dobila GMP validaciju. Boja je mogla da se zameni. Lek nije mogao. Razlika koju je Lillie povukao 1969. ista je ona koja danas određuje šta se nalazi u bočici. :::