A história do azul de metileno: de corante a medicamento e investigação

O azul de metileno chegou a um doente antes de chegar a uma farmácia.

O relatório de 1891 de Paul Guttmann e Paul Ehrlich sobre a utilização do corante na malária contém dois gráficos de temperatura. O segundo abrange o período de 13 de julho a 5 de agosto, com o tratamento registado na margem, dia após dia. As entradas de 18 e 19 de julho indicam "1 × 0,05 Methylenblau". Nos dias seguintes são registadas cinco e sete doses da mesma quantidade e, em 22 de julho, uma pequena quantidade de quinina passa também a constar do registo. A linha da febre, que oscila entre 37 °C e 39.5 °C durante a primeira metade do gráfico, estabiliza depois de surgir o corante e mantém-se entre cerca de 36 °C e 37.5 °C durante as três semanas restantes.

O doente era um de dois, descritos no artigo como um empregado doméstico e um marinheiro. O composto que receberam era um corante têxtil comercial havia quinze anos, e os dois homens estão entre as primeiras pessoas de que há registo terem sido tratadas com um fármaco totalmente sintético dirigido a um organismo específico.

O corante veio primeiro

O primeiro corante sintético comercialmente bem-sucedido foi criado por William Henry Perkin em 1856. Perkin tinha dezoito anos, trabalhava num laboratório doméstico durante as férias da Páscoa e tentava sintetizar quinina. Em vez disso, obteve um resíduo negro, dissolveu-o e encontrou uma cor que se fixava de forma brilhante à seda. Patenteou-a em agosto de 1856 e, no final de 1857, já tinha uma fábrica a fornecer uma tinturaria de seda em Londres.

Em 1875 Adolf von Baeyer sintetizou um corante vermelho e chamou-lhe eosina, de Eos, a palavra grega para alvorada. Em 1876 Heinrich Caro, então diretor do laboratório da Badische Anilin- und Soda-Fabrik, desenvolveu o azul de metileno com Baeyer como um corante à base de anilina para algodão. A sua estrutura química só ficou estabelecida cerca de nove anos mais tarde.

Essa origem continua visível na forma como a substância é designada. "Azul de metileno" é um nome comercial proveniente do catálogo de corantes, e não uma descrição química. O composto a que se refere é cloreto de metiltionínio, e as distinções entre o nome, o sal e os seus hidratos tornam-se importantes assim que alguém pesa o material ou lê uma especificação.

A coloração foi a ponte

O percurso das tinturarias até ao hospital passou pelo microscópio e começou antes de o azul de metileno existir. Wilhelm Erb foi a primeira pessoa a aplicar um corante sintético ao sangue, utilizando ácido pícrico em 1865, e observou um padrão reticular no interior de alguns glóbulos vermelhos.

A tese de doutoramento de Paul Ehrlich, de 1878, comparou a coloração histológica com o tingimento de têxteis e defendeu que ambos eram reações químicas. Trabalhando sob a orientação de Robert Koch no bacilo da tuberculose, classificou os corantes de anilina em classes ácidas e básicas e estabeleceu que cada classe coloria diferentes partes de uma célula. Em 1880 misturou as duas: uma solução saturada de azul de metileno vertida em fucsina ácida até o sobrenadante ficar límpido. O resultado, a que chamou neutralen Farbkörper, ou coloração neutra, produziu três cores em vez de uma, revelou grânulos nas células polimorfonucleares que até então não eram visíveis e tornou possível a primeira contagem diferencial de leucócitos. Como esses grânulos absorviam ambos os componentes da mistura, Ehrlich criou a palavra neutrófilo para as células que os continham.

Dois anos mais tarde, Koch utilizou azul de metileno para identificar o bacilo da tuberculose e, em 1883, Ehrlich melhorou o método. Em 1886 publicou uma observação de outro tipo: injetou o corante em animais vivos, comparou a intensidade com que cada órgão o absorvia e concluiu que apresentava uma afinidade acentuada pelo cérebro e pelo tecido nervoso. Atribuiu essa afinidade ao ciclo de oxidação-redução do corante, que tinha observado no ano anterior. Esse ciclo explica também por que razão uma solução de azul de metileno perde a cor quando o seu oxigénio é consumido e a recupera quando o ar regressa. As experiências que mediram pela primeira vez as consequências desse ciclo pertencem a uma década posterior, e o próprio mecanismo é um tema distinto da história.

O parasita e o núcleo púrpura

Alphonse Laveran encontrou o parasita da malária em 1880 ao examinar sangue fresco não corado. Para o observar rotineiramente num esfregaço seco era necessária uma coloração, e as colorações da época produziam apenas vermelho e azul.

Em 1888, o patologista polaco Czesław Cheçinski substituiu a fucsina ácida por eosina, produzindo uma mistura de azul de metileno e eosina. O caso que esteve na origem do seu método foi o de um soldado que morreu de malária em 30 de setembro de 1887. Nos esfregaços de sangue, Cheçinski observou formas azuis semelhantes a margaridas, hoje reconhecidas como Plasmodium malariae, e formas em foice, hoje reconhecidas como os gametócitos de Plasmodium falciparum. O resultado pôs simultaneamente fim a duas explicações concorrentes da doença: a teoria dos miasmas e a alegação de Edwin Klebs e Corrado Tommasi-Crudeli de que a malária era causada por uma bactéria.

O parasita era visível. O seu núcleo não era, o que deixava em aberto a sua natureza. Ernst Malachowski, médico em Breslau, resolveu esse problema primeiro por acaso e depois deliberadamente. Em 1889 observou uma coloração diferencial do núcleo do plasmódio numa preparação e não conseguiu reproduzi-la. Acidificar o azul de metileno não ajudou. Alcalinizá-lo com bórax produzia o efeito todas as vezes. Demonstrou a técnica publicamente em 15 de junho de 1890 e publicou-a no mesmo ano, apresentando um método mais completo em agosto de 1891.

Dmitri Romanowsky publicou a sua própria versão em setembro de 1891. Os seus melhores resultados vieram de um frasco negligenciado e bolorento de solução de azul de metileno com mais de dois meses. O método de Malachowski era deliberado e, nas suas palavras, facilmente reproduzível; o de Romanowsky foi um beco sem saída que funcionou uma vez. Ainda assim, o epónimo ficou associado a Romanowsky, e a disputa sobre quem produziu o púrpura que tornou o núcleo visível é uma história separada, com os seus próprios documentos.

Figura: o segundo gráfico de temperatura do relatório de 1891 de Guttmann e Ehrlich. O painel superior abrange 13 a 24 de julho e o painel inferior 25 de julho a 5 de agosto; as entradas na margem indicam as doses administradas, e a temperatura mantém-se próxima do normal durante as três semanas finais do registo. Reproduzido a partir do relatório digitalizado para Krafts, Hempelmann e Skórska-Stania, Parasitology Research 111:1–6 (2012), PMID 22411634.

A maturação revelou-se uma desmetilação

Ninguém envolvido na década de 1890 sabia o que a "maturação" fazia ao azul de metileno. A resposta surgiu da química industrial. Heinrich August Bernthsen tinha sintetizado o composto-base fenotiazina em 1883, estabeleceu em 1885 que o azul de metileno pertencia a essa família e demonstrou, no mesmo período, que condições alcalinas removem grupos metilo do corante, produzindo os compostos hoje designados azures.

Bernard Nocht extraiu a fração ativa em 1898 e 1899 e só conseguiu chamar-lhe Rot aus Methylenblau, vermelho de azul de metileno. Michaelis identificou-a como azure I em 1901. Jenner introduziu metanol absoluto como solvente para o precipitado do corante em 1899, eliminando a necessidade de fixar os esfregaços de sangue pelo calor; Leishman e Reuter combinaram ambos os avanços; Wright publicou um método simplificado em 1902. A contribuição de Giemsa, também em 1902, consistiu em deixar de depender de uma solução maturada aleatoriamente e passar a utilizar quantidades medidas de corantes conhecidos. Depois recusou-se a publicar como produzia azure de metileno puro e vendeu o método ao laboratório do Dr. Grübler, que comercializou o produto como azure I e alegou que apenas a sua versão constituía uma coloração de Giemsa autêntica.

Duas guerras mundiais concluíram o processo por acaso. Quando os corantes alemães deixaram de estar disponíveis, Lillie, Roe e Wilcox trabalharam com os substitutos americanos e verificaram que a melhor coloração provinha de três componentes separados: azul de metileno puro, o seu produto de degradação azure B, e eosina. Estes três continuam a ser os principais componentes da coloração utilizada atualmente para diagnosticar a malária, sob um nome que hoje reúne Malachowski, Wright e Giemsa.

Figura: formas em anel de Plasmodium falciparum em glóbulos vermelhos humanos, coradas com um método do tipo Romanowsky. A estrutura púrpura no interior do anel é a cromatina que o azul de metileno tratado com bórax de Malachowski tornou visível pela primeira vez. Imagem de Ernst Hempelmann, disponibilizada em domínio público.

Um nome, vários materiais

Os anos que separaram esses componentes deixaram um problema que perdurou para além da química. Ralph Lillie traçou a distinção, em 1969, entre corantes biológicos, "fabricados segundo especificações rigorosas compatíveis com as suas utilizações delicadas e exigentes", e corantes não biológicos para coloração têxtil, que "exigem normas de fabrico menos rigorosas e exigentes". Ambos os tipos de produto tinham o mesmo nome, e a diferença entre eles nunca foi apenas uma questão de grau. Uma especificação escrita para algodão e uma especificação escrita para um reagente de diagnóstico não são intercambiáveis, e um material produzido segundo a especificação têxtil não se destinava a ser ingerido.

Azure B é a ilustração mais clara. É a forma monodesmetilada do azul de metileno, tem atividade farmacológica própria mensurável e esteve presente como constituinte não controlado de preparações clínicas de azul de metileno durante mais de um século antes de alguém separar os dois. Um grupo verificou que tecido humano recolhido em autópsia após administração de azul de metileno continha 5 a 14 por cento de azul de metileno inalterado e 86 a 95 por cento de azure B. Se uma determinada preparação deve conter azure B, e em que limite, é uma questão de especificação, e a investigação sobre azure B como impureza e metabolito retoma o assunto a partir daí.

É também na especificação que reside a consequência prática. A conformidade com a USP é a via para a pureza mais elevada que o mercado oferece, porque se trata de uma norma de ensaio completa e publicada, e não de uma única medição. Abrange identidade, doseamento, impurezas orgânicas incluindo os corantes azure, solventes residuais, impurezas elementares, resíduo de ignição, limites microbianos e endotoxinas bacterianas. Um certificado que apresenta um resultado de metais pesados e o designa como conformidade com a USP apresentou apenas uma linha dessa lista.

A Blupreme obtém o seu azul de metileno de um fabricante farmacêutico e publica o certificado de análise completo, testando toda a especificação USP em vez de apenas os metais pesados. O guia para ler um certificado de análise e o que a designação USP estabelece e não estabelece explicam como verificar o documento face à alegação.

O que a história permite afirmar, e o que não permite

A linhagem é real e é mais longa do que a maioria das páginas de produto sugere. O azul de metileno foi utilizado no tratamento da malária em 1891, foi descrito como sedativo em casos de psicose agitada em 1899, e a sua cadeia lateral estende-se pela quinacrina, cloroquina, prometazina e clorpromazina. O artigo de Ehrlich de 1890 com Arthur Leppmann descreveu alívio da dor nevrálgica e reumática e, em seguida, considerou e decidiu não testar o corante em doença mental.

Nada disso estabelece uma utilização moderna. O resultado de 1891 na malária baseou-se em dois doentes e num gráfico de temperatura. A familiaridade prolongada com uma molécula é uma razão para a estudar, não um resultado. A história do composto como fármaco e os ensaios modernos na malária respondem a questões diferentes das que Ehrlich colocava, e os endpoints têm de ser interpretados nos seus próprios termos.

Há um pormenor no registo que pertence ao presente, e não ao passado. Quando investigadores realizaram ensaios de azul de metileno para a malária no Burkina Faso na década de 2000, viram-se a competir por material de grau farmacêutico e relataram que o preço da matéria-prima tinha aumentado por um fator de cerca de cem assim que passou a ter validação GMP. Um corante podia ser substituído. Um fármaco não. A distinção traçada por Lillie em 1969 é a mesma que determina o que uma garrafa contém atualmente.