Metileno mėlynasis ir mitochondrijos: elektronų pernaša ir įrodymai

Įsivaizduokite du greta esančius preparatus. Abiejuose yra smegenų mitochondrijų, paveiktų rotenonu – chemine medžiaga, kuri blokuoja kvėpavimo grandinės I kompleksą. Į vieną iš jų eksperimentuotojas pipete įlašina mikromolinę metileno mėlynojo dozę. Deguonies suvartojimas iš dalies atsikuria. Membranos potencialas iš dalies grįžta. Vėl prasideda nedidelės apimties ATP sintezė. Gretimoje kiuvetėje peroksido jutiklis atskleidžia kitą šio reiškinio pusę: vandenilio peroksido susidarymas padidėjo kelis kartus, esant kiekvienai tirtai dozei ir naudojant kiekvieną išbandytą substratą.

Abu rodmenys teisingi. Metileno mėlynasis yra elektronų pernešiklis, galintis palaikyti elektronų srautą aplink pažeistą kvėpavimo grandinės dalį, tačiau už šią pernašą tenka mokėti peroksido susidarymo kaina. Turint omenyje abu faktus, literatūra apie metileno mėlynojo poveikį mitochondrijų funkcijai tampa suprantama. Atsižvelgiant tik į vieną, ji atrodo kaip pasakojimas apie stebuklą arba grėsmę – priklausomai nuo to, kurį straipsnį atsivertėte pirmiausia.

Elektronų pernaša, paaiškinta paprastai

Kvėpavimo grandinė yra nuosekli perdavimo sistema. Elektronai į ją patenka per I kompleksą (iš NADH) arba per II kompleksą ir susijusius flavino fermentus (iš sukcinato ir panašių donorų), keliauja per III kompleksą į judrų pernešiklį citochromą c, o tada per IV kompleksą – į deguonį. Kiekvienas perdavimas pumpuoja protonus per vidinę membraną, o susidaręs gradientas varo ATP sintezę. Užblokavus bet kurią grandį, ankstesnėje grandinės dalyje srautas sustoja.

Metileno mėlynasis įsiterpia kaip lygiagrečiai veikiantis kurjeris. Jo oksiduota forma paima elektronus iš ankstesnių grandinės pernešiklių ir tampa bespalve redukuota forma – leukometileno mėlynuoju. Ši perduoda elektronus tolesnėms grandims ir vėl tampa mėlyna. Abi formos aprašytos redokso poros paaiškinime, o platesnis šios perdavimo sistemos veikimas aptariamas bendrame veikimo mechanizmo paaiškinime. Atviras klausimas – kur kurjeris vėl įsilieja į grandinę: III komplekso chinolio prisijungimo kišenėje, vadinamoje Qo vieta, ar tiesiogiai ties citochromu c. Kuris perdavimo kelias vyrauja, priklauso nuo sąlygų, kaip išsamiai paaiškinta III komplekso apėjimo analizėje.

Ką iš tikrųjų matavo trys tyrimai su graužikais

Visuose trijuose tyrimuose naudotos izoliuotos smegenų mitochondrijos, t. y. iš ląstelės pašalintos organelės, suspenduotos apibrėžtos sudėties buferiniame tirpale. Nebuvo nei nepažeistų ląstelių, nei gyvūnų, kuriems būtų skirta medžiaga, nei tiriamųjų žmonių. Koncentracijos nurodo organeles supantį tirpalą, o ne žmogui per burną vartojamą dozę. Nepamirštant šio konteksto, skaičiai tampa aiškūs.

Pirmajame tyrime, atliktame su izoliuotomis jūrų kiaulyčių smegenų mitochondrijomis, esant nuo 100 nanomolių iki 2 mikromolių koncentracijai, nauda ir jos kaina įvertintos tame pačiame preparate. Sveikose mitochondrijose dažiklis padidino deguonies suvartojimą ramybės būsenoje, tačiau nepakeitė ADP stimuliuojamo kvėpavimo, todėl su kvėpavimu susietos ATP gamybos nepadidino. Užblokavus I kompleksą, 2 mikromolių koncentracija padidino ATP sintezę nuo 46 iki 93 nanomolių per minutę vienam miligramui, palyginti su normaliu maždaug 1109 greičiu. Užblokavus III kompleksą, ta pati dozė padidino ATP sintezę nuo maždaug 46 iki 63, palyginti su normaliu maždaug 910 greičiu. Membranos potencialas ir kalcio įsiurbimas iš dalies atsikūrė. Cianidu sukelto IV komplekso blokavimo apeiti nepavyko, taigi naudingas elektronų perdavimas vyksta iki veikiančio IV komplekso. Kiekvienas funkcijos atkūrimo atvejis buvo statistiškai patvirtintas, bet nedidelis: ATP gamyba siekė tik vienženklę procentinę normalaus lygio dalį.

Antrasis tyrimas, atliktas su pelių smegenų žievės mitochondrijomis, esant maždaug 1 mikromolio koncentracijai, patvirtino I komplekso apėjimą ir nustatė ribą ties III kompleksu. Rotenonas sumažino kvėpavimo greitį nuo maždaug 121 iki mažiau nei 2 nanomolių deguonies per minutę vienam miligramui, o dažiklis jį padidino iki maždaug 21 – apytikriai vienos šeštosios normalaus lygio. Tuo pat metu membranos potencialas atsikūrė beveik visiškai. Tačiau užblokavus III kompleksą nei kvėpavimas, nei potencialas neatsikūrė visame nuo 1 iki 5 mikromolių koncentracijų intervale, o blokavimas slopino dažiklio sukeltą peroksido signalą. Autoriai pasiūlė, kad redukuotas dažiklis elektronus perduoda III komplekso Qo vietoje: kai ši vieta užimta, kurjeris neturi kur jų pristatyti.

Trečiasis tyrimas, atliktas su pelių, žiurkių ir jūrų kiaulyčių smegenų mitochondrijomis, daugiausia esant 2 mikromolių koncentracijai, tiesiogiai patikrino šį neatitikimą ir nustatė, kad III komplekso blokavimą galima apeiti. Qo vietos inhibitoriui miksotiazoliui sumažinus bazinį kvėpavimo greitį 88 procentais, dažiklis atkūrė deguonies suvartojimą iki maždaug 62 procentų neužblokuotos grandinės lygio. Tiesioginio bandymo metu pusės mikromolio koncentracijos dažiklis redukavo egzogeninį citochromą c net ir tada, kai III kompleksas buvo užblokuotas. Tai patvirtino kelią nuo NADH per dažiklį į citochromą c ir toliau į IV kompleksą. Tačiau atkurtas kvėpavimas vyko neįprastai: pridėtas ADP deguonies suvartojimą mažino, o ne didino, o ATP sintezės blokavimas skatino kvėpavimą. Membranos potencialas atsikūrė tik iš dalies. Didelis deguonies suvartojimas, kai kvėpavimo ir ATP sintezės sąsaja yra priešinga įprastai, nėra normali energijos gamyba.

Kodėl laboratorijų rezultatai skiriasi ir kas tai paaiškina

Pirmiausia atkrinta paaiškinimas, grindžiamas rūšių skirtumais. Trečioji grupė pakartojo darbą su trimis graužikų rūšimis ir visose nustatė kokybiškai tokį patį apėjimą, įskaitant pelių liniją, kurioje anksčiau buvo pranešta, kad apėjimo nėra. Skyrėsi koncentracija (1 ir 2 mikromoliai), inhibitorių dozės, buferiniai tirpalai, izoliavimo metodai ir, svarbiausia, lyginama energetinė būsena: apėjimas ryškiausias prieš pridedant ADP, būtent tada, kai pasireiškia paradoksalus atsakas į ADP. Todėl tikslioje schemoje vaizduojami du nuo sąlygų priklausantys perdavimo taškai: vienas Qo vietoje, kitas ties citochromu c. Kurjeris pristato elektronus ten, kur leidžia vietinės cheminės sąlygos.

Peroksido kaina

Šios kainos duomenys tokie pat nuoseklūs kaip ir funkcijos atkūrimo duomenys. Tyrime su jūrų kiaulytėmis dažiklis padidino peroksido išsiskyrimą visomis tirtomis sąlygomis – ramybės būsenoje, vykstant ATP sintezei ir esant cheminiam pažeidimui – naudojant visus tris substratus. ATP sintezės metu, esant 1 mikromolio koncentracijai, peroksido išsiskyrimas padidėjo nuo maždaug 148 iki daugiau nei 1500 pikomolių per minutę vienam miligramui, o net 100 nanomolių koncentracija signalą padidino daugiau nei keturis kartus. Dažiklis taip pat maždaug 2.6 karto sulėtino peroksido šalinimą, todėl signalas atspindi ir spartesnį susidarymą, ir lėtesnį pašalinimą. Siūlomas cheminis paaiškinimas – tiesioginis deguonies redukavimas redukuotu dažikliu, neaptinkant superoksido, nors tai tebėra interpretacija, o ne įrodytas reakcijos etapas.

Tyrimas su pelėmis šį vaizdą naudingai papildo. Didėjant dozei, peroksido išsiskyrimas staigiai augo: nuo pradinio maždaug 76 iki beveik 2000 pikomolių per minutę vienam miligramui, esant 2 mikromolių koncentracijai. Vis dėlto III komplekso blokavimas slopino dažiklio sukeltą komponentą. Jei peroksidas susidarytų tik redukuotam dažikliui reaguojant su deguonimi, grandinės blokavimas neturėtų tokios didelės įtakos. Tačiau turi, vadinasi, procese dalyvauja ir grandinė. Antioksidacinio ir prooksidacinio poveikio apžvalga šį dvilypumą aptaria platesniame kontekste, o deguonies suvartojimo ir ATP analizė paaiškina, kodėl vien deguonies rodikliai niekada nepatvirtina teiginio apie energiją.

Dalinis funkcijos atkūrimas nėra pažaidų pašalinimas

Formuluotė, kurios reikėtų atsisakyti, yra „ar metileno mėlynasis atkuria mitochondrijas“. Toks atkūrimas reikštų ilgalaikį pažaidų pašalinimą: atkurtus kompleksus, kvėpavimo ir ATP sintezės susiejimą, išliekantį medžiagai pasišalinus, funkcijos atsikūrimą nepažeistose ląstelėse, o vėliau – geresnę gyvo organizmo funkciją. Nė vienas iš trijų straipsnių to neparodo. Jie rodo ūmų elektronų srauto nukreipimą kitu keliu ką tik izoliuotose organelėse, esant dirbtiniam cheminiam blokavimui, kai ATP gamyba sudaro tik nedidelę normalaus lygio dalį, o kvėpavimo ir ATP sintezės sąsaja kartais būna akivaizdžiai neįprasta. Rotenonas ir antimicinas yra laboratorinės priemonės, o ne senėjimo ar žmogaus mitochondrijų ligų modeliai. Nė vienas iš šių rezultatų nereiškia daugiau energijos sveikam žmogui – tai atskiras įrodymų klausimas, kuriam skirta atskira tyrimų su žmonėmis literatūra.

Trys ribos padeda bet kokias biohakingo išvadas išlaikyti sąžiningas. Pirma, koncentracija tirpale nėra dozė: nuo 0.1 iki 2 mikromolių koncentracija aplink izoliuotas organeles nieko nepasako apie tai, koks per burną vartojamas kiekis sukurtų tokią laisvos medžiagos koncentraciją ties žmogaus smegenų mitochondrija, ypač todėl, kad dažiklio kaupimasis ar išsiskyrimas priklauso nuo paties membranos potencialo. Antra, deguonis nėra energija: dažiklis gali didinti deguonies suvartojimą tiek dėl redokso ciklų ir elektronų nuotėkio, tiek dėl produktyvaus fosforilinimo, todėl respirometrija be ATP ir membranos potencialo rodmenų neleidžia pagrįsti teiginio apie energiją. Trečia, nauda ir našta turi būti įvardytos viename sakinyje: bet koks teiginys apie atkurtą membranos potencialą ar ATP gamybą, kuriame nutylimas kartu padidėjęs peroksido kiekis, netiksliai perteikia eksperimentą. Kitos susijusios išlygos aptariamos straipsniuose apie NAD redokso pusiausvyrą, dozės ir atsako kreivės formą ir tyrimų metodų vadove.

Viena praktinė pastaba: elektronų pernaša yra būtent šios konkrečios molekulės savybė. Demetilinti giminingi junginiai, tokie kaip Azure B, taip pat yra redokso požiūriu aktyvūs, tačiau veikia kitaip, todėl iš dalies suiręs tirpalas reiškia kitokį eksperimentą nei nepakitęs dažiklis. Tai viena priežasčių reikalauti atitikties visai farmakopėjos specifikacijai ir viešai paskelbto partijos dokumento, o ne vien metalų tyrimo. Šviesos sukeliamos cheminės reakcijos yra dar viena išlyga, kai medžiaga naudojama apšviesta; tai aptariama straipsnyje apie derinius su raudona šviesa.

Siauras teiginys išlieka pagrįstas ir vertas išsaugoti: metileno mėlynasis tam tikromis sąlygomis gali veikti kaip elektronų kurjeris pažeistose izoliuotose mitochondrijose, iš dalies palaikydamas srautą peroksido susidarymo kaina. Visa, kas peržengia šią ribą – energija, ilgaamžiškumas, pažaidų pašalinimas – laukia įrodymų, kurių šie tyrimai niekada nebuvo skirti pateikti.