Metileno mėlio istorija: nuo dažiklio iki vaisto ir mokslinių tyrimų

Metileno mėlis pacientą pasiekė anksčiau nei vaistinę.

1891 m. Paulio Guttmanno ir Paulio Ehrlicho ataskaitoje apie dažiklio naudojimą maliarijai pateiktos dvi temperatūros diagramos. Antroji apima laikotarpį nuo 13 July iki 5 August, o paraštėje diena po dienos užrašytas taikytas gydymas. 18 ir 19 July įrašuose nurodyta „1 × 0,05 Methylenblau“. Kitomis dienomis nurodytos penkios ir septynios tokio pat kiekio dozės, o iki 22 July įraše atsiranda ir nedidelis chinino kiekis. Temperatūros kreivė, kuri pirmoje diagramos pusėje svyruoja tarp 37 °C ir 39.5 °C, pavartojus dažiklį išsilygina ir likusias tris savaites išlieka maždaug tarp 36 °C ir 37.5 °C.

Pacientas buvo vienas iš dviejų; straipsnyje jie apibūdinti kaip namų tarnas ir jūreivis. Jiems skirtas junginys penkiolika metų buvo komercinis tekstilės dažiklis, o šie du vyrai yra vieni pirmųjų žmonių, apie kuriuos užfiksuota, kad jie buvo gydomi visiškai sintetiniu vaistu, nukreiptu į konkretų organizmą.

Pirmiausia buvo dažiklis

Pirmąjį komerciškai sėkmingą sintetinį dažiklį 1856 m. sukūrė Williamas Henry Perkinas. Perkinui buvo aštuoniolika, per Velykų atostogas jis dirbo namų laboratorijoje ir bandė susintetinti chininą. Vietoj jo gavo juodas nuosėdas, jas ištirpino ir aptiko dažiklį, kuris itin ryškiai nuspalvindavo šilką. 1856 m. August jis jį užpatentavo, o iki 1857 m. pabaigos jau turėjo gamyklą, tiekiančią dažiklį vienai Londono šilko dažyklai.

1875 m. Adolfas von Baeyeris susintetino raudoną dažiklį ir pavadino jį eozinu pagal Eos — graikišką aušros pavadinimą. 1876 m. Heinrichas Caro, tuo metu vadovavęs Badische Anilin- und Soda-Fabrik laboratorijai, kartu su Baeyeriu sukūrė metileno mėlio junginį kaip anilino pagrindo dažiklį medvilnei. Jo cheminė struktūra galutinai nustatyta tik maždaug po devynerių metų.

Ši kilmė tebematyti iš medžiagos pavadinimo. „Methylene blue“ yra prekybinis pavadinimas iš dažiklių katalogo, o ne cheminis aprašas. Juo vadinamas junginys yra metiltioninio chloridas, o pavadinimo, druskos ir jos hidratų skirtumai tampa svarbūs vos tik kas nors pradeda sverti medžiagą ar skaityti specifikaciją.

Tiltu tapo dažymas

Kelias iš dažyklos į ligoninę ėjo per mikroskopą ir prasidėjo dar prieš atsirandant metileno mėliui. Wilhelm Erbas buvo pirmasis žmogus, 1865 m. kraujui panaudojęs sintetinį dažiklį — pikrino rūgštį — ir kai kurių eritrocitų viduje pamatęs tinklišką struktūrą.

1878 m. Paulio Ehrlicho daktaro disertacijoje histologinis dažymas buvo lyginamas su tekstilės dažymu ir teigiama, kad abu procesai yra cheminės reakcijos. Dirbdamas su Robertu Kochu ir tirdamas tuberkuliozės bacilą, jis suskirstė anilino dažiklius į rūgštinius ir bazinius bei nustatė, kad kiekviena klasė nudažo skirtingas ląstelės dalis. 1880 m. jis abu tipus sumaišė: sotus metileno mėlio tirpalas buvo pilamas į rūgštinį fuksiną, kol viršutinis skysčio sluoksnis tapo skaidrus. Gautas mišinys, kurį jis pavadino neutralen Farbkörper, arba neutraliu dažikliu, suteikė tris spalvas vietoj vienos, išryškino iki tol nematytas polimorfonuklearinių ląstelių granules ir leido pirmą kartą atlikti diferencinį leukocitų skaičiavimą. Kadangi šios granulės prisijungė abu mišinio komponentus, Ehrlichas ląstelėms, kuriose jos buvo, sukūrė terminą neutrofilas.

Po dvejų metų Kochas metileno mėliu aptiko tuberkuliozės bacilą, o 1883 m. Ehrlichas metodą patobulino. 1886 m. jis paskelbė kitokio pobūdžio stebėjimą: dažiklį suleido gyviems gyvūnams, palygino, kaip stipriai jį pasisavina skirtingi organai, ir padarė išvadą, kad jis turi ryškų afinitetą smegenų ir nervų audiniams. Šį afinitetą jis siejo su dažiklio oksidacijos-redukcijos ciklu, kurį buvo pastebėjęs ankstesniais metais. Dėl šio ciklo metileno mėlio tirpalas taip pat praranda spalvą, kai sunaudojamas jame esantis deguonis, ir ją atgauna, kai vėl patenka oro. Eksperimentai, kuriais pirmą kartą išmatuotos šio ciklo pasekmės, priklauso vėlesniam dešimtmečiui, o pats mechanizmas yra atskira nuo istorijos tema.

Parazitas ir violetinis branduolys

Alphonse'as Laveranas maliarijos parazitą aptiko 1880 m. tirdamas šviežią, nedažytą kraują. Kad jį būtų galima reguliariai matyti išdžiovintame tepinėlyje, reikėjo dažiklio, o to meto dažymo metodai suteikdavo tik raudoną ir mėlyną spalvas.

1888 m. lenkų patologas Czesławas Cheçinskis rūgštinį fuksiną pakeitė eozinu ir taip sukūrė metileno mėlio bei eozino mišinį. Jo metodo pagrindu tapo kario, mirusio nuo maliarijos 30 September 1887, atvejis. Kraujo tepinėliuose Cheçinskis matė mėlynas, į saulutes panašias formas, dabar atpažįstamas kaip Plasmodium malariae, ir pjautuvo formos darinius, dabar atpažįstamus kaip Plasmodium falciparum gametocitai. Rezultatas vienu metu paneigė du konkuruojančius ligos paaiškinimus: miazmų teoriją ir Edwino Klebso bei Corrado Tommasi-Crudeli teiginį, kad maliariją sukelia bakterija.

Parazitas buvo matomas. Jo branduolys — ne, todėl jo prigimtis liko neaiški. Breslau gydytojas Ernstas Malachowskis šią problemą išsprendė iš pradžių atsitiktinai, o paskui sąmoningai. 1889 m. viename preparate jis pastebėjo diferencinį plazmodijaus branduolio nusidažymą, tačiau negalėjo jo pakartoti. Metileno mėlio rūgštinimas nepadėjo. Pašarminus jį boraksu, efektas pasireikšdavo kiekvieną kartą. Techniką jis viešai pademonstravo 15 June 1890 ir tais pačiais metais ją paskelbė, o August 1891 pateikė išsamesnį metodą.

Dmitrijus Romanowsky savo metodikos versiją paskelbė September 1891. Geriausius rezultatus jis gavo iš užmiršto, pelėto, daugiau kaip dviejų mėnesių senumo metileno mėlio tirpalo butelio. Malachowskio metodas buvo sąmoningai sukurtas ir, jo žodžiais, lengvai atkuriamas; Romanowsky metodas buvo aklavietė, suveikusi vieną kartą. Vis dėlto eponimas atiteko Romanowsky, o ginčas dėl to, kas išgavo violetinę spalvą, leidusią pamatyti branduolį, yra atskira istorija su savais dokumentais.

Paveikslas: antroji temperatūros diagrama iš Guttmanno ir Ehrlicho 1891 m. ataskaitos. Viršutinė dalis apima laikotarpį nuo 13 iki 24 July, o apatinė — nuo 25 July iki 5 August; paraštės įrašuose nurodytos skirtos dozės, o paskutines tris įrašo savaites temperatūra išlieka artima normaliai. Atkurta iš ataskaitos skenuotos kopijos, naudotos Krafts, Hempelmann ir Skórska-Stania straipsnyje, Parasitology Research 111:1–6 (2012), PMID 22411634.

Paaiškėjo, kad „brandinimas“ buvo demetilinimas

Nė vienas 1890-ųjų tyrėjas nežinojo, ką metileno mėliui daro jo „brandinimas“. Atsakymas atėjo iš pramoninės chemijos. Heinrichas Augustas Bernthsenas 1883 m. susintetino pirminį junginį fenotiaziną, 1885 m. nustatė, kad metileno mėlis priklauso šiai junginių šeimai, ir tuo pačiu laikotarpiu parodė, kad šarminės sąlygos pašalina iš dažiklio metilo grupes, susidarant junginiams, kurie dabar vadinami azūrais.

Bernardas Nochtas aktyviąją frakciją išskyrė 1898 ir 1899 m. ir galėjo ją pavadinti tik Rot aus Methylenblau — raudonuoju iš metileno mėlio. Michaelis 1901 m. nustatė, kad tai azure I. Jenneris 1899 m. pradėjo naudoti absoliutų metanolį kaip dažiklio nuosėdų tirpiklį, todėl nebereikėjo kraujo tepinėlių fiksuoti kaitinant; Leishmanas ir Reuteris sujungė abu patobulinimus; Wrightas 1902 m. paskelbė supaprastintą metodą. Giemsos indėlis, taip pat 1902 m., buvo atsisakyti atsitiktinai subrandinto tirpalo ir vietoje jo naudoti išmatuotus žinomų dažiklių kiekius. Vėliau jis atsisakė skelbti, kaip gamino gryną metileno azūrą, ir pardavė metodą Dr. Grüblerio laboratorijai, kuri produktą pateikė rinkai kaip azure I ir teigė, kad tik jos versija yra autentiškas Giemsos dažiklis.

Du pasauliniai karai šį procesą netyčia užbaigė. Kai vokiškų dažiklių nebebuvo galima gauti, Lillie, Roe ir Wilcoxas tyrė amerikietiškus pakaitalus ir nustatė, kad geriausiai dažo trys atskirti komponentai: grynas metileno mėlis, jo skilimo produktas azure B ir eozinas. Šie trys komponentai iki šiol sudaro pagrindinę maliarijai diagnozuoti naudojamo dažymo metodo dalį, kurio pavadinime dabar kartu minimi Malachowskis, Wrightas ir Giemsa.

Paveikslas: Plasmodium falciparum žiedinės formos žmogaus eritrocituose, nudažytos Romanowsky tipo metodu. Violetinė struktūra žiedo viduje yra chromatinas, kurį Malachowskio boraksu apdorotas metileno mėlis pirmą kartą padarė matomą. Ernst Hempelmann nuotrauka, perduota viešajai sričiai.

Vienas pavadinimas, kelios medžiagos

Metai, per kuriuos šie komponentai buvo atskirti, paliko problemą, gyvavusią ilgiau nei pati chemijos neaiškumo era. Ralphas Lillie 1969 m. aiškiai atskyrė biologinius dažiklius, „gaminamus pagal griežtas specifikacijas, atitinkančias jų subtilų ir tikslumo reikalaujantį naudojimą“, nuo nebiologinių tekstilės dažiklių, kuriems „taikomi ne tokie griežti ir reiklūs gamybos standartai“. Abiejų rūšių produktai vadinosi tuo pačiu pavadinimu, tačiau skirtumas tarp jų niekada nebuvo vien kokybės laipsnio klausimas. Medvilnei skirta specifikacija ir diagnostiniam reagentui skirta specifikacija nėra tarpusavyje pakeičiamos, o pagal tekstilės specifikaciją pagaminta medžiaga nebuvo skirta nuryti.

Azure B yra aiškiausias pavyzdys. Tai monodemetilinta metileno mėlio forma, turinti išmatuojamą farmakologinį aktyvumą, ir daugiau kaip šimtmetį ji buvo nekontroliuojama klinikinių metileno mėlio preparatų sudedamoji dalis, kol šie du junginiai buvo atskirti. Viena tyrėjų grupė nustatė, kad žmogaus audiniuose, paimtuose per autopsiją po metileno mėlio vartojimo, buvo 5 iki 14 per cent nepakitusio metileno mėlio ir 86 iki 95 per cent azure B. Ar konkrečiame preparate turėtų būti azure B ir kokia jo riba turėtų būti, yra specifikacijos klausimas, o azure B kaip priemaišos ir metabolito tyrimai šį klausimą nagrinėja toliau.

Būtent specifikacijoje slypi ir praktinė pasekmė. Atitiktis USP yra kelias į didžiausią rinkoje siūlomą grynumą, nes tai yra išsamus paskelbtas bandymų standartas, o ne vienas matavimas. Jis apima tapatybės nustatymą, kiekio nustatymą, organines priemaišas, įskaitant azūrinius dažiklius, tirpiklių likučius, elementines priemaišas, likutį po kaitinimo, mikrobiologines ribas ir bakterinius endotoksinus. Sertifikate, kuriame pateiktas sunkiųjų metalų rezultatas ir tai pavadinta USP atitiktimi, nurodyta tik viena šio sąrašo eilutė.

Blupreme metileno mėlis gaunamas iš farmacijos gamintojo, o bendrovė skelbia visą analizės sertifikatą ir tikrina pagal visą USP specifikaciją, o ne vien sunkiuosius metalus. Analizės sertifikato skaitymo vadove ir straipsnyje apie tai, ką USP žymėjimas patvirtina ir ko nepatvirtina, paaiškinta, kaip dokumentą palyginti su teiginiu.

Ką istorija leidžia teigti, o ko ne

Ši raidos linija yra reali ir ilgesnė, nei leidžia suprasti dauguma produktų puslapių. Metileno mėlis 1891 m. buvo naudotas maliarijai gydyti, 1899 m. aprašytas kaip raminamoji priemonė esant sujaudintai psichozei, o jo šoninės grandinės cheminė raida tęsiasi per kvinakriną, chlorokviną, prometaziną ir chlorpromaziną. 1890 m. Ehrlicho ir Arthuro Leppmanno straipsnyje aprašytas neuralginio ir reumatinio skausmo palengvėjimas, o vėliau svarstyta galimybė tirti dažiklį psichikos ligų atvejais, tačiau nuo tokio bandymo atsisakyta.

Niekas iš to savaime nepagrindžia šiuolaikinio naudojimo. 1891 m. maliarijos rezultatas buvo du pacientai ir temperatūros diagrama. Ilga pažintis su molekule yra priežastis ją tirti, o ne tyrimo rezultatas. Junginio kaip vaisto istorija ir šiuolaikiniai maliarijos tyrimai atsako į kitokius klausimus nei tie, kuriuos kėlė Ehrlichas, todėl jų vertinamąsias baigtis reikia nagrinėti pagal jų pačių kriterijus.

Istoriniame įraše yra viena detalė, priklausanti ne praeičiai, o dabarčiai. Kai 2000-aisiais tyrėjai Burkina Fase vykdė metileno mėlio maliarijos tyrimus, jiems teko konkuruoti dėl farmacinės kokybės medžiagos, ir jie pranešė, kad žaliavos kaina, gavus GMP patvirtinimą, išaugo maždaug šimtą kartų. Dažiklį buvo galima pakeisti kitu. Vaisto — ne. Skirtumas, kurį Lillie apibrėžė 1969 m., yra tas pats skirtumas, kuris ir šiandien lemia, kas iš tikrųjų yra buteliuke. :::