La storia del blu di metilene: da colorante a medicinale e alla ricerca

Il blu di metilene raggiunse un paziente prima di arrivare in farmacia.

Il rapporto del 1891 di Paul Guttmann e Paul Ehrlich sull'uso del colorante nella malaria contiene due grafici della temperatura. Il secondo va dal 13 luglio al 5 agosto, con il trattamento annotato lungo il margine giorno per giorno. Le registrazioni del 18 e 19 luglio riportano "1 × 0,05 Methylenblau". Nei giorni successivi sono indicate cinque e sette dosi della stessa quantità e, entro il 22 luglio, nel registro compare anche una piccola quantità di chinino. La linea della febbre, che oscilla tra 37 °C e 39.5 °C nella prima metà del grafico, si appiattisce dopo la comparsa del colorante e rimane tra circa 36 °C e 37.5 °C per le tre settimane successive.

Il paziente era uno dei due descritti nell'articolo come un domestico e un marinaio. Il composto che ricevettero era stato per quindici anni un colorante tessile commerciale, e i due uomini sono tra le prime persone di cui sia documentato il trattamento con un farmaco completamente sintetico diretto contro un organismo specifico.

Prima venne il colorante

Il primo colorante sintetico di successo commerciale fu creato da William Henry Perkin nel 1856. Perkin aveva diciotto anni, lavorava in un laboratorio domestico durante le vacanze di Pasqua e cercava di sintetizzare il chinino. Ottenne invece un residuo nero, lo sciolse e scoprì un colore che si fissava brillantemente sulla seta. Lo brevettò nell'agosto 1856 e, entro la fine del 1857, aveva una fabbrica che riforniva una tintoria di seta londinese.

Nel 1875 Adolf von Baeyer sintetizzò un colorante rosso e lo chiamò eosina, da Eos, la parola greca per l'alba. Nel 1876 Heinrich Caro, allora direttore del laboratorio della Badische Anilin- und Soda-Fabrik, sviluppò con Baeyer il blu di metilene come colorante a base di anilina per il cotone. La sua struttura chimica non fu definita fino a circa nove anni dopo.

Quell'origine è ancora visibile nel modo in cui la sostanza viene denominata. "Blu di metilene" è un nome commerciale proveniente dal catalogo dei coloranti, non una descrizione chimica. Il composto a cui si riferisce è il cloruro di metiltioninio, e le distinzioni tra il nome, il sale e i suoi idrati diventano importanti non appena si pesa il materiale o si legge una specifica.

La colorazione fu il ponte

Il percorso dalle tintorie all'ospedale passò attraverso il microscopio e iniziò prima che il blu di metilene esistesse. Wilhelm Erb fu il primo ad applicare un colorante sintetico al sangue, usando acido picrico nel 1865, e osservò una struttura reticolare all'interno di alcuni globuli rossi.

La tesi di dottorato di Paul Ehrlich del 1878 confrontava la colorazione istologica con la tintura dei tessuti e sosteneva che entrambe fossero reazioni chimiche. Lavorando sotto Robert Koch sul bacillo della tubercolosi, classificò i coloranti all'anilina in classi acide e basiche e stabilì che ciascuna classe colorava parti diverse di una cellula. Nel 1880 mescolò le due: una soluzione satura di blu di metilene versata nella fucsina acida finché il surnatante non diventava limpido. Il risultato, che chiamò neutralen Farbkörper o colorazione neutra, produceva tre colori invece di uno, rivelava granuli nelle cellule polimorfonucleate che prima non erano stati visibili e rese possibile il primo conteggio differenziale dei leucociti. Poiché quei granuli assorbivano entrambi i componenti della miscela, Ehrlich coniò la parola neutrofilo per le cellule che li contenevano.

Due anni dopo Koch usò il blu di metilene per individuare il bacillo della tubercolosi e, nel 1883, Ehrlich migliorò il metodo. Nel 1886 pubblicò un'osservazione di tipo diverso: iniettò il colorante in animali vivi e confrontò quanto intensamente ciascun organo lo assorbiva, concludendo che aveva una marcata affinità per il cervello e il tessuto nervoso. Attribuì tale affinità al ciclo di ossidoriduzione del colorante, che aveva osservato l'anno precedente. Quel ciclo è anche il motivo per cui una soluzione di blu di metilene perde colore quando il suo ossigeno viene consumato e lo riacquista quando ritorna l'aria. Gli esperimenti che per primi misurarono le conseguenze di quel ciclo appartengono a un decennio successivo, e il meccanismo stesso è un argomento distinto dalla storia.

Il parassita e il nucleo viola

Alphonse Laveran individuò il parassita della malaria nel 1880 esaminando sangue fresco non colorato. Per osservarlo regolarmente in uno striscio essiccato serviva una colorazione, e le colorazioni dell'epoca producevano soltanto rosso e blu.

Nel 1888 il patologo polacco Czesław Cheçinski sostituì la fucsina acida con l'eosina, producendo una miscela di blu di metilene ed eosina. Il caso alla base del suo metodo riguardava un soldato morto di malaria il 30 settembre 1887. Negli strisci di sangue Cheçinski osservò forme blu simili a margherite, oggi riconosciute come Plasmodium malariae, e forme a falce, oggi riconosciute come i gametociti di Plasmodium falciparum. Il risultato pose fine contemporaneamente a due spiegazioni concorrenti della malattia: la teoria del miasma e l'affermazione di Edwin Klebs e Corrado Tommasi-Crudeli secondo cui la malaria era causata da un batterio.

Il parassita era visibile. Il suo nucleo no, e questo lasciava aperta la questione della sua natura. Ernst Malachowski, medico a Breslavia, risolse il problema prima per caso e poi intenzionalmente. Nel 1889 notò una colorazione differenziale del nucleo plasmodiale in un preparato e non riuscì a riprodurla. Acidificare il blu di metilene non servì. Alcalinizzarlo con borace produceva invece l'effetto ogni volta. Dimostrò pubblicamente la tecnica il 15 giugno 1890 e la pubblicò nello stesso anno, presentando un metodo più dettagliato nell'agosto 1891.

Dmitri Romanowsky pubblicò la propria versione nel settembre 1891. I suoi risultati migliori provenivano da una bottiglia trascurata e ammuffita di soluzione di blu di metilene vecchia di oltre due mesi. Il resoconto di Malachowski descriveva un procedimento deliberato e, nelle sue parole, facilmente riproducibile; quello di Romanowsky era un vicolo cieco che funzionò una volta. L'eponimo andò comunque a Romanowsky, e la disputa su chi produsse il viola che rese visibile il nucleo è una storia separata, con documenti propri.

Figura: il secondo grafico della temperatura tratto dal rapporto di Guttmann ed Ehrlich del 1891. Il pannello superiore copre il periodo dal 13 al 24 luglio e quello inferiore dal 25 luglio al 5 agosto; le annotazioni a margine indicano le dosi somministrate e la temperatura rimane prossima alla norma nelle ultime tre settimane della registrazione. Riprodotto dal rapporto nella scansione utilizzata da Krafts, Hempelmann e Skórska-Stania, Parasitology Research 111:1–6 (2012), PMID 22411634.

La maturazione si rivelò una demetilazione

Nessuno tra coloro che lavoravano negli anni 1890 sapeva cosa facesse la "maturazione" al blu di metilene. La risposta arrivò dalla chimica industriale. Heinrich August Bernthsen aveva sintetizzato il composto progenitore fenotiazina nel 1883, stabilito nel 1885 che il blu di metilene apparteneva a quella famiglia e dimostrato nello stesso periodo che le condizioni alcaline rimuovono gruppi metilici dal colorante, producendo i composti oggi chiamati azure.

Bernard Nocht estrasse la frazione attiva nel 1898 e nel 1899 e poté soltanto chiamarla Rot aus Methylenblau, rosso da blu di metilene. Michaelis la identificò come azure I nel 1901. Jenner introdusse nel 1899 il metanolo assoluto come solvente per il precipitato del colorante, eliminando la necessità di fissare a caldo gli strisci di sangue; Leishman e Reuter combinarono entrambi i progressi; Wright pubblicò un metodo semplificato nel 1902. Il contributo di Giemsa, sempre nel 1902, consistette nello smettere di fare affidamento su una soluzione maturata casualmente e nell'utilizzare invece quantità misurate di coloranti noti. In seguito rifiutò di pubblicare come produceva l'azure di metilene puro e vendette il metodo al laboratorio del Dr. Grübler, che commercializzò il prodotto come azure I e sostenne che soltanto la propria versione fosse un'autentica colorazione di Giemsa.

Due guerre mondiali completarono accidentalmente il processo. Quando i coloranti tedeschi divennero introvabili, Lillie, Roe e Wilcox lavorarono sui sostituti americani e scoprirono che la colorazione migliore derivava da tre componenti separati: blu di metilene puro, il suo prodotto di degradazione Azure B ed eosina. Questi tre restano i componenti principali della colorazione utilizzata ancora oggi per diagnosticare la malaria, sotto un nome che ormai riunisce Malachowski, Wright e Giemsa.

Figura: forme ad anello di Plasmodium falciparum nei globuli rossi umani, colorate con un metodo di tipo Romanowsky. La struttura viola all'interno dell'anello è la cromatina che il blu di metilene trattato con borace di Malachowski rese visibile per la prima volta. Immagine di Ernst Hempelmann, rilasciata nel pubblico dominio.

Un nome, diversi materiali

Gli anni trascorsi prima che quei componenti venissero separati lasciarono un problema che sopravvisse alla chimica. Ralph Lillie tracciò nel 1969 una distinzione tra coloranti biologici, "prodotti secondo specifiche rigorose commisurate ai loro impieghi delicati ed esigenti", e coloranti non biologici destinati alla tintura dei tessuti, che "richiedono standard di produzione meno rigorosi ed esigenti". Entrambi i tipi di prodotto portavano lo stesso nome e la differenza tra loro non fu mai una semplice differenza di grado. Una specifica scritta per il cotone e una specifica scritta per un reagente diagnostico non sono intercambiabili, e un materiale prodotto secondo quella tessile non era destinato a essere ingerito.

Azure B è l'esempio più chiaro. È la forma monodemetilata del blu di metilene, possiede una propria attività farmacologica misurabile ed è stato presente come componente non controllato delle preparazioni cliniche di blu di metilene per oltre un secolo prima che qualcuno separasse i due. Un gruppo rilevò che tessuto umano prelevato durante autopsie dopo la somministrazione di blu di metilene conteneva dal 5 al 14 per cento di blu di metilene invariato e dall'86 al 95 per cento di Azure B. Se una determinata preparazione debba contenere Azure B, e con quale limite, è una questione di specifica, e la ricerca su Azure B come impurità e metabolita riprende l'argomento da lì.

È nella specifica che si trova anche la conseguenza pratica. La conformità USP è la via verso il massimo livello di purezza offerto dal mercato, perché costituisce uno standard di prova completo e pubblicato, non una singola misurazione. Copre identità, titolo, impurità organiche comprese le azure, solventi residui, impurità elementari, residuo all'incenerimento, limiti microbiologici ed endotossine batteriche. Un certificato che riporta un risultato relativo ai metalli pesanti e lo definisce conformità USP ha riportato una sola voce di quell'elenco.

Blupreme ottiene il proprio blu di metilene da un produttore farmaceutico e pubblica il certificato di analisi completo, verificando l'intera specifica USP anziché soltanto i metalli pesanti. La guida alla lettura di un certificato di analisi e ciò che la designazione USP stabilisce e non stabilisce spiegano come verificare il documento rispetto all'affermazione.

Ciò che la storia autorizza a concludere, e ciò che non autorizza

La discendenza storica è reale ed è più lunga di quanto lasci intendere la maggior parte delle pagine di prodotto. Il blu di metilene fu usato per trattare la malaria nel 1891, fu segnalato come sedativo nella psicosi agitata nel 1899, e la sua linea di derivati passa attraverso quinacrina, clorochina, prometazina e clorpromazina. L'articolo del 1890 di Ehrlich con Arthur Leppmann descriveva un sollievo dal dolore nevralgico e reumatico, per poi considerare e decidere di non testare il colorante nelle malattie mentali.

Nulla di tutto ciò dimostra un uso moderno. Il risultato sulla malaria del 1891 riguardava due pazienti e un grafico della temperatura. Una lunga familiarità con una molecola è un motivo per studiarla, non un risultato. La storia del composto come farmaco e gli studi moderni sulla malaria rispondono a domande diverse da quelle che si poneva Ehrlich, e gli endpoint devono essere letti secondo i propri criteri.

C'è un dettaglio nella documentazione che appartiene al presente più che al passato. Quando i ricercatori condussero studi sulla malaria con blu di metilene in Burkina Faso negli anni 2000, si trovarono a competere per ottenere materiale di grado farmaceutico e riferirono che il prezzo della materia prima era aumentato di un fattore di circa cento una volta ottenuta la validazione GMP. Un colorante poteva essere sostituito. Un farmaco no. La distinzione tracciata da Lillie nel 1969 è la stessa che ancora oggi determina cosa contiene una bottiglia.