Articolo
Come funziona il blu di metilene: trasferimento di elettroni e dove arrivano gli elettroni
Un matraccio tappato su un banco è l'introduzione più breve e onesta a come funziona il blu di metilene. Acqua, glucosio, un pizzico di idrossido di sodio e abbastanza colorante da rendere il liquido di un blu intenso e inconfondibile. Dopo qualche minuto, il blu scompare finché il matraccio sembra contenere soltanto acqua. Agitatelo e il colore ritorna di colpo. Poi svanisce di nuovo, e continuerà a farlo finché ci saranno glucosio disposto a cedere elettroni e ossigeno disposto ad accettarli.
Nel colorante non è cambiato nulla, tranne il numero di elettroni che trasporta. Quando è ossidato, è blu. Quando è ridotto, non lo è. Quasi tutto il resto della letteratura terapeutica e di ricerca su questa molecola deriva da questo singolo passaggio reversibile, perché una molecola capace di prendere elettroni da un partner e passarli a un altro è una navetta, e una navetta da sola non fa nulla. Ciò che fa dipende interamente da ciò che si trova alle sue due estremità.
Due forme e perché la coppia è importante
La forma ossidata è un sistema ad anelli planare e caricato positivamente. È proprio questa forma piatta e carica a spiegare perché si dispone a contatto con gli acidi nucleici, perché si lega alle strutture sialilate sulle membrane cellulari e perché assorbe fortemente la luce visibile tra circa 600 e 700 nanometres, cioè la parte dello spettro che l'occhio umano percepisce come blu.
La forma ridotta è una situazione diversa. Non porta carica, si scioglie nei grassi anziché nell'acqua ed è incolore. La sua ionizzazione è molto bassa al pH interno dell'organismo, nell'ordine di pochi punti percentuali. Per questo la molecola ridotta attraversa facilmente una membrana cellulare per diffusione e, una volta all'interno, dove l'ambiente è più ossidante, può essere riossidata e di fatto intrappolata. Il sistema ad anelli ossidato è piatto; quello ridotto può torcersi. Queste conseguenze strutturali, e lo stesso cambiamento di colore, fanno parte a pieno titolo della storia delle due forme e sono trattate più dettagliatamente nel confronto tra blu di metilene e leucometilene blu.
Accettare elettroni
Il colorante ossidato accetta elettroni da un'ampia gamma di donatori. Il glucosio nel matraccio dimostrativo è uno di questi. All'interno di una cellula, altri donatori sono i nucleotidi piridinici ridotti e i componenti della catena mitocondriale di trasporto degli elettroni. Quando il blu di metilene viene ridotto in un tessuto che contiene ossigeno, il ciclo che instaura consuma sia l'agente riducente sia l'ossigeno e produce specie reattive dell'ossigeno, soprattutto perossido di idrogeno. Il colorante esce dal ciclo invariato, pronto a ripeterlo.
Quest'ultimo punto spiega una contraddizione che altrimenti sembrerebbe una leggerezza. Nella letteratura il blu di metilene viene descritto sia come pro-ossidante sia come antiossidante, ed entrambe le descrizioni sono difendibili. Può ridurre la produzione di superossido agendo come accettore artificiale di elettroni, deviando il flusso di elettroni dai siti enzimatici in cui altrimenti l'ossigeno verrebbe convertito in radicali superossido. In colture di cellule epatiche è stato dimostrato che induce enzimi di difesa antiossidante di fase 2, tra cui tioredossina reduttasi 1 e NADPH chinone ossidoreduttasi. Quale delle due facce si osservi dipende da quale estremità della navetta sia a corto di elettroni in quel momento. Una domanda come "il blu di metilene è un antiossidante?" non è ben formulata finché non si specificano il sistema, la concentrazione e quali altre sostanze siano presenti.
Cedere gli elettroni
Una volta che il colorante trattiene un elettrone in più, possono accadere tre cose molto diverse, che di solito vengono descritte sotto un'unica voce. Non dovrebbero esserlo.
Può passare l'elettrone a un centro metallico. Il caso più chiaro è quello dell'emoglobina ossidata dallo stato ferroso a quello ferrico. In tale stato non può trasportare ossigeno. Nei globuli rossi, un enzima riduce il colorante e il colorante ridotto trasferisce poi elettroni in modo non enzimatico al ferro eme ossidato, ripristinando l'emoglobina funzionale e riportando il colorante alla sua forma ossidata. Il colorante non viene consumato in questo processo; entra in ciclo. Il quadro clinico basato su questa reazione è materia ospedaliera, e la spiegazione del blu di metilene nella metaemoglobinemia descrive come viene utilizzato e perché è sottoposto a una supervisione così stretta.
Una nota necessaria sulle fonti: le due revisioni su cui si basa questo articolo non indicano lo stesso cofattore riducente per il passaggio enzimatico, una citando NADH e l'altra NADPH. Il disaccordo è reale e rimane irrisolto nelle fonti disponibili qui, quindi la descrizione più prudente consiste nell'indicare il ruolo di ciascun componente anziché scegliere il nome di un singolo cofattore.
Può trasferire energia, o un elettrone, all'ossigeno, se è presente luce. Questa via esiste soltanto sotto illuminazione. Il colorante eccitato raggiunge uno stato di tripletto e da lì sono possibili due meccanismi. Nel primo, il colorante eccitato interagisce direttamente con una molecola vicina, sottraendo un idrogeno o trasferendo un elettrone, con conseguente formazione di radicali; reagendo in questo modo con l'acqua produce radicali ossidrilici. Nel secondo, l'energia di eccitazione viene trasferita direttamente all'ossigeno, producendo ossigeno singoletto, una specie altamente elettrofila che decade entro microseconds ed è generalmente considerata la principale via attraverso cui il blu di metilene illuminato danneggia le cellule microbiche. Tra gli esiti documentati figurano reazioni con lipidi e peptidi dell'involucro cellulare e con le basi di guanina nel DNA.
La conseguenza pratica di questa via è che l'illuminazione modifica i valori di ordini di grandezza. Nei dati raccolti da Wainwright e Crossley, il blu di metilene contro Pseudomonas aeruginosa presenta una concentrazione battericida minima di circa 500 micromolar al buio e di circa 25 micromolar con una dose luminosa di 12 joules per square centimetre. Contro un ceppo di Staphylococcus aureus, i valori al buio e sotto illuminazione sono entrambi 5 micromolar. In altre parole, il fatto che la molecola possa essere considerata o meno un antimicrobico non è una proprietà della sola molecola; è una proprietà della molecola insieme alla luce.
Può agire direttamente su un sito enzimatico, senza la navetta. Il blu di metilene ossida il ferro ferroso legato all'ossido nitrico sintasi, inattivando l'enzima. Blocca la guanilato ciclasi solubile, e una concentrazione compresa tra 1 e 10 micromolar è quella utilizzata abitualmente in laboratorio a questo scopo. Inibisce la monoamino ossidasi di tipo A con un IC50 compreso tra 27 e 180 nanomolar, che è il meccanismo alla base dell'interazione ben documentata con gli inibitori della ricaptazione della serotonina e il motivo per cui le interazioni farmacologiche del blu di metilene costituiscono una categoria a sé.
Queste tre vie sono chimicamente distinte. Ridurle tutte a un'unica affermazione secondo cui il blu di metilene funziona tramite cicli redox è la ragione principale per cui così tanti testi sull'argomento risultano contemporaneamente sicuri di sé e vaghi.
Quattro distinzioni che determinano se un'affermazione sul meccanismo significhi davvero qualcosa
Quale forma. Il colorante ridotto non è intercambiabile con quello ossidato. L'inibizione dell'acetilcolinesterasi illustra bene la trappola: durante una lunga incubazione in vitro, il blu di metilene viene progressivamente ridotto alla sua forma incolore e l'inibizione diminuisce, perché la molecola ridotta non inibisce quell'enzima. Un saggio protratto abbastanza a lungo da modificare la forma registrerà un effetto più debole e inviterà a una spiegazione errata.
Quale concentrazione. L'intervallo di laboratorio per l'inibizione della guanilato ciclasi solubile è da 1 a 10 micromolar. Per abolire la trasmissione mediata dal glutammato in sezioni di ippocampo di ratto sono serviti da 5 a 50 micromolar. Effetti tossici nelle colture cellulari sono riportati sopra 100 micromolar. Non si tratta dello stesso esperimento, e un meccanismo confermato a 50 micromolar non è automaticamente applicabile a un paziente la cui concentrazione plasmatica ne rappresenta solo una frazione.
Quale via. La biodisponibilità orale assoluta è di circa 72 per cent e l'emivita plasmatica terminale è di 5 a 7 hours. La somministrazione orale produce concentrazioni più elevate nell'intestino e nel fegato; la somministrazione endovenosa produce concentrazioni più elevate nel cervello. La via determina quale tessuto incontra gli elettroni.
Quale modello e se le luci erano accese. Gran parte della letteratura sui meccanismi deriva da colture cellulari e studi sui roditori, e i risultati in vitro su questa molecola dipendono dall'esposizione alla luce, dal potenziale di membrana e dallo stato redox delle cellule, perché la lampada di un microscopio è sufficiente a fotosensibilizzarla. Tra 65 e 85 per cent di una dose somministrata viene ridotta alla forma incolore nei globuli rossi e nei tessuti periferici. Ognuna di queste variabili si interpone tra un meccanismo ben definito in una piastra e un'affermazione riferita a una persona.
Perché la questione della purezza è una questione chimica
L'illuminazione demetila il blu di metilene. Il primo prodotto è Azure B, poi Azure A, quindi tionina, e un'intensità luminosa maggiore produce una degradazione superiore rispetto a una minore. Una molecola la cui utilità consiste nella capacità di accettare e cedere elettroni è quindi una molecola i cui probabili prodotti di degradazione sono stretti parenti chimici che rimangono nella stessa soluzione. La composizione di ciò che si trova nel contenitore non è un dettaglio cosmetico.
Per questo motivo, la conformità alla specifica USP è il test significativo per un acquirente. Un prodotto che non la soddisfa è un colorante, e un colorante contiene impurità, tra cui Azure B, metalli pesanti e solventi residui, che una persona che lo ingerisce non vuole assumere. Un'ulteriore trappola è rappresentata da un venditore che esegue test soltanto sui metalli pesanti e presenta il risultato come piena conformità. Blupreme ha stretto una partnership con un produttore farmaceutico di blu di metilene e verifica l'intera specifica: identità, purezza, impurità organiche, solventi residui, impurità elementari, residuo all'incenerimento, limiti microbici ed endotossine batteriche. Il documento dei test di laboratorio relativo a ciascun lotto viene pubblicato, e scegliere un fornitore consiste in gran parte nel verificare se tale documento esista e che cosa copra.
Una coppia reversibile. Diverse vie che ne derivano. È la via a determinare che cosa si può affermare. :::
Un matraccio chiuso su un banco di laboratorio offre una dimostrazione essenziale di come funziona il blu di metilene. Si mescolano acqua, glucosio, un pizzico di idrossido di sodio e una quantità di colorante sufficiente a rendere il liquido di un blu intenso e inequivocabile. Dopo alcuni minuti, il colore si attenua fino a far sembrare il matraccio pieno d'acqua. Basta agitarlo perché il blu ricompaia immediatamente. Poco dopo svanisce di nuovo, e il ciclo continua finché il glucosio può cedere elettroni e l'ossigeno può riceverli.
Il colorante, in realtà, non è cambiato se non per il numero di elettroni che porta con sé. Nella forma ossidata è blu; nella forma ridotta non lo è. Da questo singolo passaggio reversibile deriva gran parte di ciò che viene descritto nella letteratura terapeutica e di ricerca sulla molecola. Una sostanza capace di accettare elettroni da un partner e trasferirli a un altro funziona infatti come un tramite, e un tramite non determina da solo il risultato: ciò che accade dipende da ciò che si trova alle sue due estremità.
Due forme e perché la coppia è importante
La forma ossidata consiste in un sistema ad anelli planare con carica positiva. Proprio questa geometria piatta e carica spiega la sua capacità di impilarsi contro gli acidi nucleici, di legarsi alle strutture sialilate presenti sulle membrane cellulari e di assorbire intensamente la luce visibile tra circa 600 e 700 nanometres, nella regione dello spettro che l'occhio umano interpreta come blu.
La forma ridotta presenta proprietà diverse. È priva di carica, si scioglie nei grassi invece che nell'acqua ed è incolore. Al pH presente all'interno dell'organismo, la sua ionizzazione è molto bassa, dell'ordine di pochi punti percentuali. Di conseguenza, la molecola ridotta può attraversare facilmente una membrana cellulare per diffusione; una volta entrata in un ambiente più ossidante, può essere riossidata e rimanere di fatto intrappolata. Il sistema ad anelli della forma ossidata è piatto, mentre quello della forma ridotta può torcersi. Queste differenze strutturali, insieme alla variazione di colore, sono parte integrante del comportamento delle due forme e vengono approfondite nel confronto tra blu di metilene e leucometilene blu.
Accettare elettroni
La forma ossidata del colorante può ricevere elettroni da numerosi donatori. Nel matraccio dimostrativo, uno di questi è il glucosio. In una cellula, tra i possibili donatori figurano invece i nucleotidi piridinici ridotti e alcuni componenti della catena mitocondriale di trasporto degli elettroni. Quando il blu di metilene viene ridotto in un tessuto che contiene ossigeno, il ciclo risultante consuma sia l'agente riducente sia l'ossigeno e genera specie reattive dell'ossigeno, soprattutto perossido di idrogeno. Alla fine del ciclo, il colorante riemerge invariato e può ripeterlo.
Questo comportamento chiarisce un'apparente contraddizione frequente nella letteratura: il blu di metilene viene descritto sia come pro-ossidante sia come antiossidante, e in contesti appropriati entrambe le definizioni possono essere sostenute. Può limitare la formazione di superossido agendo da accettore artificiale di elettroni e deviando il loro flusso lontano dai siti enzimatici nei quali l'ossigeno verrebbe altrimenti convertito in radicali superossido. In colture di cellule epatiche è stato inoltre dimostrato che induce enzimi di difesa antiossidante di fase 2, tra cui tioredossina reduttasi 1 e NADPH chinone ossidoreduttasi. Quale comportamento prevalga dipende da quale estremità del trasferimento abbia bisogno di elettroni in quel momento. Chiedere semplicemente "il blu di metilene è un antiossidante?" non è sufficiente senza specificare il sistema, la concentrazione e le altre sostanze presenti.
Cedere gli elettroni
Quando il colorante ha acquisito un elettrone in più, i passaggi successivi possono seguire almeno tre vie chimicamente differenti. Riunirle sotto un'unica spiegazione tende a nascondere differenze importanti.
Può trasferire l'elettrone a un centro metallico. L'esempio più netto riguarda l'emoglobina passata per ossidazione dallo stato ferroso a quello ferrico. In questa condizione non è in grado di trasportare ossigeno. Nei globuli rossi, un enzima riduce il colorante; successivamente, il colorante ridotto trasferisce elettroni in modo non enzimatico al ferro eme ossidato, ripristinando l'emoglobina funzionale e tornando a sua volta alla forma ossidata. Il colorante non viene consumato: continua a circolare nel ciclo. L'uso clinico che sfrutta questa reazione appartiene al contesto ospedaliero, e la spiegazione del blu di metilene nella metaemoglobinemia descrive come viene impiegato e perché richiede una supervisione così stretta.
Va inoltre segnalata una discrepanza nelle fonti. Le due revisioni su cui si basa questo articolo non indicano lo stesso cofattore riducente per il passaggio enzimatico: una riporta NADH, l'altra NADPH. Le fonti disponibili qui non risolvono il contrasto, quindi è più corretto descrivere la funzione dei singoli componenti senza attribuire il processo a un unico cofattore.
Può trasferire energia, o un elettrone, all'ossigeno in presenza di luce. Questa via è possibile soltanto quando il colorante viene illuminato. Una volta eccitato, raggiunge uno stato di tripletto da cui possono partire due meccanismi. Nel primo, interagisce direttamente con una molecola vicina sottraendo un idrogeno oppure trasferendo un elettrone, con formazione di radicali; una reazione di questo tipo con l'acqua produce radicali ossidrilici. Nel secondo, l'energia di eccitazione viene ceduta direttamente all'ossigeno, generando ossigeno singoletto, una specie fortemente elettrofila che decade entro microseconds ed è generalmente considerata la principale via attraverso cui il blu di metilene illuminato danneggia le cellule microbiche. Tra gli effetti documentati vi sono reazioni con lipidi e peptidi dell'involucro cellulare e con le basi di guanina del DNA.
Da questa via deriva una conseguenza pratica rilevante: l'illuminazione può modificare i valori di ordini di grandezza. Nei dati raccolti da Wainwright e Crossley, il blu di metilene contro Pseudomonas aeruginosa presenta una concentrazione battericida minima di circa 500 micromolar al buio e di circa 25 micromolar sotto una dose luminosa di 12 joules per square centimetre. Per un ceppo di Staphylococcus aureus, invece, il valore è 5 micromolar sia al buio sia sotto illuminazione. In altre parole, il comportamento antimicrobico non dipende esclusivamente dalla molecola, ma dalla combinazione tra molecola e luce.
Può agire direttamente su un sito enzimatico, senza passare attraverso il ciclo di trasferimento. Il blu di metilene ossida il ferro ferroso legato all'ossido nitrico sintasi, rendendo inattivo l'enzima. Blocca anche la guanilato ciclasi solubile; in laboratorio, la concentrazione comunemente utilizzata a questo scopo è compresa tra 1 e 10 micromolar. Inoltre inibisce la monoamino ossidasi di tipo A con un IC50 compreso tra 27 e 180 nanomolar. Questo meccanismo è alla base dell'interazione ben documentata con gli inibitori della ricaptazione della serotonina e spiega perché le interazioni farmacologiche del blu di metilene costituiscano un argomento distinto.
Le tre vie non sono varianti dello stesso processo: sono meccanismi chimici differenti. Trattarle tutte come una generica forma di ciclo redox è uno dei motivi per cui molte descrizioni del blu di metilene risultano al tempo stesso assertive e poco precise.
Quattro distinzioni che determinano se un'affermazione sul meccanismo significhi davvero qualcosa
Quale forma. La forma ridotta del colorante non può essere considerata equivalente a quella ossidata. L'inibizione dell'acetilcolinesterasi mostra bene il problema: durante una lunga incubazione in vitro, il blu di metilene viene progressivamente convertito nella forma ridotta e incolore, mentre l'inibizione diminuisce perché la molecola ridotta non inibisce quell'enzima. Se un saggio dura abbastanza da modificare la forma chimica presente, il risultato mostrerà un effetto più debole e potrà indurre a una spiegazione sbagliata.
Quale concentrazione. Per inibire la guanilato ciclasi solubile, l'intervallo normalmente usato in laboratorio è da 1 a 10 micromolar. Per abolire la trasmissione mediata dal glutammato in sezioni di ippocampo di ratto sono stati necessari da 5 a 50 micromolar. Nelle colture cellulari, effetti tossici vengono riportati sopra 100 micromolar. Si tratta di esperimenti differenti, e un meccanismo dimostrato a 50 micromolar non può essere dato per disponibile automaticamente in un paziente con una concentrazione plasmatica pari soltanto a una frazione di quel valore.
Quale via. La biodisponibilità orale assoluta è di circa 72 per cent, mentre l'emivita plasmatica terminale è di 5 a 7 hours. La somministrazione orale determina concentrazioni maggiori nell'intestino e nel fegato; quella endovenosa produce concentrazioni maggiori nel cervello. La via di somministrazione contribuisce quindi a determinare quale tessuto entra in contatto con gli elettroni.
Quale modello e se le luci erano accese. Una parte consistente della letteratura sui meccanismi deriva da colture cellulari e studi su roditori. Nei sistemi in vitro, i risultati relativi a questa molecola dipendono dall'esposizione alla luce, dal potenziale di membrana e dallo stato redox delle cellule, anche perché la lampada di un microscopio può essere sufficiente a fotosensibilizzarla. Tra 65 e 85 per cent di una dose somministrata viene ridotta alla forma incolore nei globuli rossi e nei tessuti periferici. Ciascuna di queste variabili separa un meccanismo ben definito osservato in laboratorio da un'affermazione riferita direttamente a una persona.
Perché la questione della purezza è una questione chimica
L'esposizione alla luce provoca la demetilazione del blu di metilene. Il primo prodotto è Azure B, seguito da Azure A e poi dalla tionina; un'intensità luminosa maggiore porta a una degradazione più marcata rispetto a un'intensità inferiore. Poiché l'utilità della molecola deriva dalla sua capacità di ricevere e cedere elettroni, i suoi probabili prodotti di degradazione sono composti chimicamente molto simili che possono rimanere nella stessa soluzione. Per questo motivo, la composizione reale del contenuto non è un dettaglio puramente estetico.
Per un acquirente, il criterio rilevante è quindi la conformità alla specifica USP. Un prodotto che non la soddisfa è un colorante, e un colorante può contenere impurità, tra cui Azure B, metalli pesanti e solventi residui, che una persona che lo ingerisce non desidera assumere. Un altro problema è rappresentato dai venditori che eseguono soltanto analisi sui metalli pesanti e presentano quel risultato come prova di conformità completa. Blupreme collabora con un produttore farmaceutico di blu di metilene e verifica l'intera specifica: identità, purezza, impurità organiche, solventi residui, impurità elementari, residuo all'incenerimento, limiti microbici ed endotossine batteriche. Il documento dei test di laboratorio relativo a ciascun lotto viene pubblicato, e scegliere un fornitore significa in larga misura verificare che tale documento esista e capire che cosa includa.
Una sola coppia reversibile, ma più possibili vie di uscita. È la via seguita a stabilire che cosa si può sostenere.