Sejarah methylene blue: dari pewarna ke obat dan penelitian

Methylene blue mencapai pasien sebelum mencapai apotek.

Laporan tahun 1891 oleh Paul Guttmann dan Paul Ehrlich tentang penggunaan pewarna tersebut pada malaria memuat dua grafik suhu. Grafik kedua mencakup 13 Juli hingga 5 Agustus, dengan pengobatan dituliskan di sepanjang margin hari demi hari. Entri pada 18 dan 19 Juli berbunyi "1 × 0,05 Methylenblau". Hari-hari berikutnya mencantumkan lima dan tujuh dosis dalam jumlah yang sama, dan pada 22 Juli sejumlah kecil quinine telah ditambahkan ke catatan. Garis demam, yang berayun antara 37 °C dan 39.5 °C sepanjang paruh pertama grafik, menjadi mendatar setelah pewarna diberikan dan tetap berada di antara sekitar 36 °C dan 37.5 °C selama tiga minggu berikutnya.

Pasien tersebut adalah satu dari dua orang, yang dalam makalah itu digambarkan sebagai seorang pembantu rumah tangga dan seorang pelaut. Senyawa yang mereka terima telah menjadi pewarna tekstil komersial selama lima belas tahun, dan kedua pria tersebut termasuk di antara orang pertama yang tercatat menerima pengobatan dengan obat yang sepenuhnya sintetis dan ditujukan pada organisme tertentu.

Pewarna hadir lebih dulu

Pewarna sintetis pertama yang sukses secara komersial dibuat oleh William Henry Perkin pada 1856. Perkin berusia delapan belas tahun, bekerja di laboratorium rumah selama liburan Paskah, dan mencoba menyintesis quinine. Sebagai gantinya ia memperoleh residu hitam, melarutkannya, dan menemukan warna yang melekat dengan cemerlang pada sutra. Ia mematenkannya pada Agustus 1856 dan pada akhir 1857 telah memiliki pabrik yang memasok sebuah usaha pencelupan sutra di London.

Pada 1875 Adolf von Baeyer menyintesis pewarna merah dan menamainya eosin, dari Eos, kata Yunani untuk fajar. Pada 1876 Heinrich Caro, yang saat itu menjabat sebagai direktur laboratorium di Badische Anilin- und Soda-Fabrik, mengembangkan methylene blue bersama Baeyer sebagai pewarna berbasis aniline untuk kapas. Struktur kimianya baru ditetapkan sekitar sembilan tahun kemudian.

Asal-usul tersebut masih terlihat dalam penamaan zat ini. "Methylene blue" adalah nama dagang dari katalog pewarna, bukan deskripsi kimia. Senyawa yang dimaksud adalah methylthioninium chloride, dan perbedaan antara nama, garam, dan hidratnya menjadi penting segera setelah seseorang menimbang bahan tersebut atau membaca suatu spesifikasi.

Pewarnaan menjadi penghubung

Jalur dari pabrik pewarna ke rumah sakit melewati mikroskop, dan itu dimulai bahkan sebelum methylene blue ada. Wilhelm Erb adalah orang pertama yang mengaplikasikan pewarna sintetis pada darah, menggunakan picric acid pada 1865, dan melihat pola retikuler di dalam beberapa sel darah merah.

Tesis doktoral Paul Ehrlich tahun 1878 membandingkan pewarnaan histologis dengan pencelupan tekstil dan berpendapat bahwa keduanya merupakan reaksi kimia. Saat bekerja di bawah Robert Koch pada tubercle bacillus, ia mengelompokkan pewarna aniline ke dalam kelas asam dan basa serta menetapkan bahwa masing-masing kelas mewarnai bagian sel yang berbeda. Pada 1880 ia mencampurkan keduanya: larutan jenuh methylene blue dituangkan ke dalam acid fuchsin hingga supernatan menjadi jernih. Hasilnya, yang ia sebut neutralen Farbkörper atau pewarna netral, menghasilkan tiga warna alih-alih satu, mengungkap granula dalam sel polimorfonuklear yang sebelumnya tidak terlihat, dan memungkinkan dilakukannya hitung diferensial leukosit pertama. Karena granula tersebut menyerap kedua komponen campuran, Ehrlich menciptakan istilah neutrophil untuk sel yang membawanya.

Dua tahun kemudian Koch menggunakan methylene blue untuk menemukan tubercle bacillus, dan pada 1883 Ehrlich menyempurnakan metode tersebut. Pada 1886 ia menerbitkan jenis pengamatan yang berbeda: ia menyuntikkan pewarna ke hewan hidup dan membandingkan seberapa kuat masing-masing organ menyerapnya, lalu menyimpulkan bahwa pewarna tersebut memiliki afinitas yang nyata terhadap jaringan otak dan saraf. Ia mengaitkan afinitas tersebut dengan siklus oksidasi-reduksi pewarna, yang telah ia amati pada tahun sebelumnya. Siklus itu juga menjadi alasan larutan methylene blue kehilangan warnanya ketika oksigennya habis dan memperoleh kembali warnanya ketika udara kembali masuk. Eksperimen yang pertama kali mengukur konsekuensi dari siklus tersebut berasal dari dekade berikutnya, dan mekanismenya sendiri merupakan topik yang terpisah dari sejarahnya.

Parasit dan inti ungu

Alphonse Laveran menemukan parasit malaria pada 1880 dengan memeriksa darah segar yang tidak diwarnai. Untuk melihatnya secara rutin dalam apusan kering diperlukan pewarnaan, dan pewarna pada masa itu hanya menghasilkan warna merah dan biru.

Pada 1888 patolog Polandia Czesław Cheçinski mengganti acid fuchsin dengan eosin, menghasilkan campuran methylene blue dan eosin. Kasus yang mendasari metodenya adalah seorang tentara yang meninggal karena malaria pada 30 September 1887. Dalam preparat darah, Cheçinski melihat bentuk biru menyerupai bunga aster, yang sekarang dikenali sebagai Plasmodium malariae, dan bentuk menyerupai sabit, yang sekarang dikenali sebagai gametosit Plasmodium falciparum. Hasil tersebut sekaligus mengakhiri dua penjelasan yang saling bersaing mengenai penyakit itu: teori miasma, dan klaim Edwin Klebs serta Corrado Tommasi-Crudeli bahwa malaria disebabkan oleh bakteri.

Parasitnya terlihat. Intinya tidak, sehingga sifatnya masih belum pasti. Ernst Malachowski, seorang dokter di Breslau, memecahkan masalah itu secara tidak sengaja dan kemudian secara sengaja. Ia melihat pewarnaan diferensial pada inti plasmodium dalam sebuah preparat pada 1889 dan tidak dapat mengulanginya. Mengasamkan methylene blue tidak membantu. Membuatnya basa dengan borax menghasilkan efek tersebut setiap kali. Ia mendemonstrasikan teknik itu di depan umum pada 15 Juni 1890 dan menerbitkannya pada tahun yang sama, dengan metode yang lebih lengkap pada Agustus 1891.

Dmitri Romanowsky menerbitkan versinya sendiri pada September 1891. Hasil terbaiknya berasal dari botol larutan methylene blue yang terabaikan dan berjamur, berusia lebih dari dua bulan. Penjelasan Malachowski bersifat disengaja dan, menurut kata-katanya, mudah direproduksi; versi Romanowsky merupakan jalan buntu yang kebetulan berhasil sekali. Meski demikian, eponim tersebut diberikan kepada Romanowsky, dan perselisihan mengenai siapa yang menghasilkan warna ungu yang membuat inti terlihat merupakan kisah terpisah dengan dokumennya sendiri.

Gambar: grafik suhu kedua dari laporan Guttmann dan Ehrlich tahun 1891. Panel atas mencakup 13 hingga 24 Juli dan panel bawah 25 Juli hingga 5 Agustus; entri pada margin menyebutkan dosis yang diberikan, dan suhu tetap mendekati normal selama tiga minggu terakhir pencatatan. Direproduksi dari laporan sebagaimana dipindai untuk Krafts, Hempelmann dan Skórska-Stania, Parasitology Research 111:1–6 (2012), PMID 22411634.

Pematangan ternyata merupakan demetilasi

Tidak seorang pun yang terlibat pada 1890-an mengetahui apa yang dilakukan "pematangan" terhadap methylene blue. Jawabannya muncul dari kimia industri. Heinrich August Bernthsen telah menyintesis senyawa induk phenothiazine pada 1883, menetapkan pada 1885 bahwa methylene blue termasuk dalam keluarga tersebut, dan pada periode yang sama menunjukkan bahwa kondisi basa melepaskan gugus methyl dari pewarna tersebut, menghasilkan senyawa yang sekarang disebut azures.

Bernard Nocht mengekstraksi fraksi aktif pada 1898 dan 1899 dan hanya dapat menyebutnya Rot aus Methylenblau, merah dari methylene blue. Michaelis mengidentifikasinya sebagai azure I pada 1901. Jenner memperkenalkan methanol absolut sebagai pelarut untuk endapan pewarna pada 1899, sehingga tidak lagi diperlukan fiksasi panas pada preparat darah; Leishman dan Reuter menggabungkan kedua kemajuan tersebut; Wright menerbitkan metode yang disederhanakan pada 1902. Kontribusi Giemsa, juga pada 1902, adalah berhenti mengandalkan larutan yang matang secara acak dan sebagai gantinya menggunakan jumlah terukur dari pewarna yang diketahui. Ia kemudian menolak memublikasikan cara membuat methylene azure murni dan menjual metode tersebut kepada laboratorium Dr. Grübler, yang memasarkan produknya sebagai azure I dan mengklaim bahwa hanya versinya yang merupakan pewarnaan Giemsa autentik.

Dua perang dunia secara tidak sengaja menuntaskan proses tersebut. Ketika pewarna Jerman tidak lagi dapat diperoleh, Lillie, Roe dan Wilcox meneliti pengganti dari Amerika dan menemukan bahwa pewarnaan terbaik berasal dari tiga komponen yang dipisahkan: methylene blue murni, produk pemecahannya azure B, dan eosin. Ketiganya tetap menjadi komponen utama pewarnaan yang digunakan untuk mendiagnosis malaria saat ini, dengan nama yang sekarang menggabungkan Malachowski, Wright dan Giemsa.

Gambar: bentuk cincin Plasmodium falciparum dalam sel darah merah manusia, diwarnai dengan metode tipe Romanowsky. Struktur ungu di dalam cincin adalah chromatin yang untuk pertama kalinya dibuat terlihat oleh methylene blue yang diberi perlakuan borax oleh Malachowski. Gambar oleh Ernst Hempelmann, dilepas ke domain publik.

Satu nama, beberapa bahan

Tahun-tahun yang memisahkan komponen-komponen tersebut meninggalkan masalah yang bertahan lebih lama daripada persoalan kimianya. Ralph Lillie pada 1969 menarik garis pembeda antara pewarna biologis, yang "diproduksi menurut spesifikasi ketat yang sepadan dengan penggunaannya yang rumit dan menuntut ketepatan", dan pewarna non-biologis untuk pencelupan tekstil, yang "memerlukan standar manufaktur yang kurang ketat dan kurang menuntut". Kedua jenis produk menggunakan nama yang sama, dan perbedaan di antara keduanya tidak pernah sekadar masalah tingkatan. Spesifikasi yang ditulis untuk kapas dan spesifikasi yang ditulis untuk reagen diagnostik tidak dapat saling dipertukarkan, dan bahan yang dibuat menurut spesifikasi tekstil tidak dimaksudkan untuk ditelan.

Azure B adalah ilustrasi yang paling jelas. Senyawa ini merupakan bentuk monodemethylated dari methylene blue, memiliki aktivitas farmakologis terukur sendiri, dan hadir sebagai konstituen yang tidak terkendali dalam sediaan klinis methylene blue selama lebih dari satu abad sebelum keduanya dipisahkan. Satu kelompok menemukan bahwa jaringan manusia yang diambil saat autopsi setelah pemberian methylene blue mengandung 5 hingga 14 per cent methylene blue yang tidak berubah dan 86 hingga 95 per cent azure B. Apakah suatu sediaan tertentu seharusnya mengandung azure B, dan pada batas berapa, merupakan pertanyaan mengenai spesifikasi, dan penelitian tentang azure B sebagai pengotor dan metabolit melanjutkan pembahasan dari sana.

Spesifikasi juga merupakan tempat konsekuensi praktisnya ditentukan. Kesesuaian dengan USP adalah jalur menuju kemurnian tertinggi yang ditawarkan pasar, karena USP merupakan standar pengujian lengkap yang dipublikasikan, bukan satu pengukuran tunggal. Standar ini mencakup identitas, assay, pengotor organik termasuk pewarna azure, pelarut residu, pengotor unsur, residue on ignition, batas mikroba, dan endotoksin bakteri. Sertifikat yang hanya melaporkan hasil logam berat lalu menyebutnya sebagai kepatuhan USP baru melaporkan satu baris dari daftar tersebut.

Blupreme memperoleh methylene blue dari produsen farmasi dan memublikasikan certificate of analysis lengkap, dengan menguji seluruh spesifikasi USP, bukan hanya logam berat. Panduan membaca certificate of analysis dan apa yang ditetapkan dan tidak ditetapkan oleh penunjukan USP membahas cara memeriksa dokumen tersebut terhadap klaim yang dibuat.

Apa yang didukung oleh sejarah, dan apa yang tidak

Riwayatnya memang nyata, dan lebih panjang daripada yang disiratkan oleh kebanyakan halaman produk. Methylene blue digunakan untuk mengobati malaria pada 1891, dilaporkan sebagai sedative pada agitated psychosis pada 1899, dan rantai turunannya mencakup quinacrine, chloroquine, promethazine dan chlorpromazine. Makalah Ehrlich tahun 1890 bersama Arthur Leppmann menggambarkan peredaan neuralgic dan rheumatic pain, lalu mempertimbangkan dan memutuskan untuk tidak menguji pewarna tersebut pada gangguan mental.

Tidak satu pun dari hal itu menetapkan penggunaan modern. Hasil malaria tahun 1891 hanya mencakup dua pasien dan satu grafik suhu. Pengalaman panjang dengan suatu molekul merupakan alasan untuk mempelajarinya, bukan sebuah hasil. Sejarah senyawa tersebut sebagai obat dan uji modern pada malaria menjawab pertanyaan yang berbeda dari pertanyaan yang diajukan Ehrlich, dan endpoint-nya harus dibaca berdasarkan konteksnya sendiri.

Ada satu detail dalam catatan tersebut yang lebih berkaitan dengan masa kini daripada masa lalu. Ketika para peneliti menjalankan uji methylene blue untuk malaria di Burkina Faso pada 2000-an, mereka mendapati diri mereka bersaing untuk mendapatkan bahan pharmaceutical-grade, dan melaporkan bahwa harga bahan baku telah meningkat sekitar seratus kali lipat setelah memiliki validasi GMP. Pewarna dapat diganti. Obat tidak. Perbedaan yang ditarik Lillie pada 1969 adalah perbedaan yang sama yang menentukan isi sebuah botol saat ini. :::