הניסויים שקישרו בין מתילן כחול לנשימה תאית

דם אנושי שהפיברין הוסר ממנו, המחומם ל־37 °C במשך שלוש שעות, צורך כשני אחוזים מהחמצן שהוא מכיל. הוספת כמות קטנה של מתילן כחול לפני ההדגרה גורמת לאותו דם לצרוך כשישים וחמישה אחוזים. דבר בתאים לא השתנה. רק התמיסה השתנתה.

הנתון הזה מגיע ממאמר שפרסמו ג'ורג' הארופ וא' ס' גוזמן בארון בג'ונס הופקינס בשנת 1928, והוא המקור לאמירה הנפוצה שמתילן כחול משפר נשימה תאית. האמירה אינה שגויה, אך משמעותה מצומצמת מכפי שנדמה.

מה המספר בטבלה מודד בפועל

המדד שנבחן היה קליטת חמצן, שנקבעה באמצעות ניתוח גזים. הארופ ובארון סיננו דם שנלקח זה עתה דרך צמר גפן ב־10 °C כדי לסלק את תאי הדם הלבנים, הרוו את הדגימה בחמצן, חילקו אותה, הוסיפו צבע לאחד החלקים וניתחו את שניהם לאחר ההדגרה. ספירת תאי הדם הלבנים עלתה רק לעיתים רחוקות על כאלף למילימטר מעוקב. צריכת החמצן דווחה כחלק מתכולת החמצן ההתחלתית של הדגימה שנעלם.

הם מדדו גם פחמן דו־חמצני, ושם השיטה הציבה קשיים. דם שהפיברין הוסר ממנו שחרר עד שני מילימול של פחמן דו־חמצני לכל 100 mL בשעה הראשונה של ההדגרה, מסיבות שלא היו קשורות לתגובה שנחקרה, ולכן אי אפשר היה להשתמש במנות הנשימה שהתקבלו מדם מלא. רק תאים שטופים בתמיסת לוק הניבו נתונים שניתן לפרש, ואלה התרכזו בין 0.73 ל־0.80, עם הצבע ובלעדיו.

הפרט הזה אינו שולי. במאמרים האלה, "נשימה" פירושה חילופי גזים בכלי סגור. הפער בין צריכת חמצן לבין תפוקת אנרגיה שימושית נבחן בנפרד במה צריכת חמצן מלמדת, ומה אינה מלמדת, על ATP.

הצבע תרם הכי הרבה במקום שבו התאים נשמו הכי מעט

בתאי דם אדומים בוגרים של יונקים כמעט אין צריכת חמצן מדידה. בתאי דם אדומים בעלי גרעין של עופות יש. הארופ ובארון בדקו את שני הסוגים, וההבדל ביניהם הוא הבסיס לטיעון שלהם.

בדגימות של יונקים גרם הצבע לעלייה של פי עשרים עד פי חמישים. בדם אווז, שתאיו כבר נשמו, הוא מעולם לא העלה את הקצב ליותר מפי שניים. ככל שהנשימה ההתחלתית הייתה גבוהה יותר, כך יכולתו של הצבע להוסיף עליה הייתה קטנה יותר.

אותו מדרג מופיע גם בתוך מין אחד. דגימת דם אנושית מחולה בפוליציתמיה ורה, שהכילה תאים לא־בוגרים, צרכה 11.3 אחוזים מהחמצן שלה ללא צבע, לעומת 2.8 אחוזים בתאים שטופים מתורם בריא. הצבע העלה את הצריכה רק ל־63.4 אחוזים — האצה של פי שישה, בעוד שבתאים רגילים נרשמה האצה של כמעט פי שלושים. הצבע גרם לתאים בוגרים להתנהג יותר כמו תאים לא־בוגרים, וזה מה שהמחברים אמרו שהוא עושה.

ציאניד היה אמור לעצור זאת

היה ידוע שציאניד עוצר חמצון תאי. הארופ ובארון הוסיפו אותו בכל זאת, לצד הצבע.

התוצאות בדם בקר מייצגות את התמונה. ללא תוספות, תכולת החמצן ירדה מ־22.61 ל־22.03 אחוזי נפח במשך שלוש שעות. עם מתילן כחול היא ירדה ל־12.84. עם מתילן כחול ואשלגן ציאניד בריכוז של אחד חלקי חמשת אלפים מולר, היא ירדה ל־12.74. השפעת הצבע כמעט שלא השתנתה.

איור: רישום רציף של מיקרו־נשימה בתאי דם אדומים אנושיים. החץ מציין את הוספת המתילן הכחול. לפניו העקומה כמעט שטוחה; אחריו היא עולה בהתמדה. מובא מתוך הארופ ובארון, Journal of Experimental Medicine 48:207–223 (1928), PMID 19869478.

מסקנתם הייתה שהצבע פעל כנשא חמצן, "וסיפק חומר שנעלם מתאי הדם האדומים חסרי הגרעין של יונקים בוגרים". שנתיים לאחר מכן ניסחו מיכאליס וסלומון ממכון רוקפלר את המחלוקת באופן שנותר בעינו. או שהשפעת הצבע הייתה "תכונה מקרית של הצבע", או שהצבע היה "מודל לחומר לא־ידוע כלשהו באורגניזמים". ההכרעה בין שתי האפשרויות האלה עדיין לא התקבלה. מה שהשתנה הוא שכיום אפשר לתאר את התאים בדיוק רב בהרבה.

תמצית כבד עשתה את אותו הדבר

מיכאליס וסלומון הראו שמיצויים של איברים במים קרים גורמים לאותו גירוי. כבד חולדה היה החזק ביותר, ואחריו כליה, טחול ואשך. למוח, לשריר ולנסיוב הדם הייתה השפעה מועטה או שלא הייתה להם השפעה כלל.

לאחר מכן בדקו את התמצית בנוכחות פחמן חד־חמצני. הנשימה שהושרתה על ידי התמצית או הצבע לא השתנתה בתערובת של 98 אחוזים פחמן חד־חמצני ו־2 אחוזים חמצן. אותה תערובת גזים עיכבה את נשימת השמרים ואת נשימתם של תאי דם אדומים בעלי גרעין של עופות בכ־60 עד 80 אחוזים, בהתאם לתיאורו של ורבורג בדבר אנזים נשימתי הרגיש לפחמן חד־חמצני. לכן החומר הלא־מזוהה ברקמה לא היה האנזים של ורבורג.

בדרך נשללו כמה מועמדים לזהות החומר. גלוטתיון מחוזר וציסטאין גרמו רק לצריכת החמצן שנדרשה לחמצון שלהם עצמם. הקואנזים של הארדן ויאנג נשלל משום שהכמות הגדולה ביותר שלו נמצאת בשריר, שבו נצפתה כמעט ההשפעה הקטנה ביותר. הציטוכרום של קיילין, שקיבל את שמו כמה שנים קודם לכן, נתקל באותה סתירה. את הצעתם שלהם, שלפיה החומר הפעיל הגיע מגרעין התא, הם כינו הצעה בלבד.

ההשפעה הייתה תלויה בתנאים

התאים היו חייבים להישאר שלמים. המוליזה באמצעות מים מזוקקים או הקפאה חוזרת ביטלה את התגובה הן לצבע והן לתמצית, והמוליזה חלקית הפחיתה אותה באופן יחסי.

גם סוכר היה נחוץ. גלוקוז, פרוקטוז וסוכרוז תמכו בנשימה שהצבע השרה; מניטול לא. בהיעדר סוכר לא הייתה נשימה כלל, ונראה שהצבע פגע בתאים תוך כדי התהליך, ולכן גלוקוז שנוסף שעה או שעתיים לאחר מכן לא החזיר אותה. המחברים הציעו שהצבע חמצן רכיב מבני שהתא נזקק לו.

הארה הגבירה במידה ניכרת את השפעת הצבע, אף שההשפעה הייתה ברורה גם בחושך. צבעים אחרים הניתנים לחיזור התנהגו אחרת: כחול טולואילן השתווה למתילן כחול או עלה עליו, ואילו אינדיגו דיסולפונט כמעט שלא עשה דבר. לא נמצא קשר ברור בין פוטנציאל החמצון־חיזור של צבע לבין עוצמת השפעתו, והמחברים ייחסו זאת לחדירות הממברנה ולרעילות.

ההשפעה תאמה את התסיסה, לא את הנשימה

מחקרו של בארון משנת 1930 עבר מתרחיפי תאים לפרוסות רקמה מאיברים תקינים של חולדות ומגידולים מושתלים.

ברקמות ללא גליקוליזה אירובית, מתילן כחול לא השפיע או דיכא מעט את צריכת החמצן: בכליה בכ־14 אחוזים, בלבלב בכ־14 אחוזים ובכבד בכ־5 אחוזים. ברקמות שמבצעות תסיסה בנוכחות חמצן הוא הגביר את הצריכה: בטחול בכ־8 אחוזים ובמוח בכ־13 אחוזים. העליות בגידולים נעו מכ־27 אחוזים בקרצינומה של שד אנושי ועד יותר מ־80 אחוזים בסרקומה על שם ראוס בתרנגולת, בקירוב ביחס לגליקוליזה האירובית בכל רקמה.

איור: כל נקודה מייצגת סוג רקמה אחד. הציר האופקי הוא גליקוליזה אירובית; הציר האנכי הוא השינוי בצריכת החמצן לאחר הוספת מתילן כחול. נתונים מתוך בארון, Journal of Experimental Medicine 52:447–456 (1930), טבלה 6, PMID 19869777.

ניסוי הציאניד הניב אז תמונת ראי. כאשר הנשימה ברקמות שלא הגיבו קודם לכן נחסמה באמצעות ציאניד והתסיסה באה לידי ביטוי, הצבע שוב הגביר את צריכת החמצן: בכליה בכ־59 אחוזים, בכבד בכ־19 אחוזים, בטחול בכ־286 אחוזים ובאשך בכ־200 אחוזים.

בארון הציע שהצבע יכול לשמש לבדיקת כושר התסיסה של תא או רקמה, וסיים בהשערה: גידול של דורות של תאי גידול במצע המכיל צבע עשוי יום אחד להפוך את חילוף החומרים של הגידול לדומה באופן קבוע לזה של רקמה תקינה. זו הייתה שאלת מחקר שנכתבה בשנת 1930. אין זו טענה טיפולית.

מה הניסויים לא יכלו למדוד

בשנים 1928 ו־1930, "נשימה" פירושה היה צריכת חמצן. אדנוזין טריפוספט דווח לראשונה בשנת 1929, וההדגמה שמיטוכונדריות מבודדות יוצרות קשרים אסטריים עם פוספט תוך העברת אלקטרונים הגיעה בשנת 1949. אף אחד ממאמרי המתילן הכחול המוקדמים לא יכול היה למדוד ייצור אנרגיה, ואף אחד מהם לא טען שעשה זאת.

התאים הם הבעיה השנייה. תאי דם אדומים בוגרים של יונקים אינם מכילים מיטוכונדריות. בשלב הרטיקולוציט הם מסלקים מיטוכונדריות וריבוזומים באמצעות אוטופגיה בררנית, ולכן תא דם אדום בוגר מסתמך על גליקוליזה ותלוי במסלול הפנטוזות־פוספט שלו בעיקר לצורך NADPH ולא לצורך ATP. בניסויי 1928 לא הייתה בתאים שרשרת העברת אלקטרונים שאפשר לתקן. מה שצרך את החמצן עשה משהו אחר.

כיום יש תיאור מבוסס למדי של אותו תהליך אחר. מתילן כחול מקבל אלקטרונים מאקוויוולנטים מחזרים בתא והופך ללוקומתילן כחול, שעובר חמצון מחדש על ידי חמצן מולקולרי וכך סוגר את המחזור. בתאי דם אדומים אנושיים, פלבין רדוקטאז התלוי ב־NADPH ורדוקטאזות דיסולפיד קשורות מבצעים את שלב החיזור. מחקר משנת 1976 שהשתמש בגלוקוז מסומן מצא שהצבע מעורר את מסלול ההקסוזות־מונופוספט, שההשפעה בריכוז נמוך הייתה תלויה באוקסיהמוגלובין, ושריכוז גבוה יותר, 0.1 mM, יצר מי חמצן. צבע מחוזר שפוגש חמצן מייצר מי חמצן, לא קשרי פוספט.

במיטוכונדריות התמונה שנויה במחלוקת יותר מכפי שהסיכומים הפופולריים מודים. קו מחקר אחד גורס שהצבע מקבל אלקטרונים מאזור קומפלקס I ומעביר אותם לציטוכרום c. מחקר אחר מצא שבמיטוכונדריות ממוח עכבר הוא אינו יכול לשחזר נשימה לאחר חסימה באנטימיצין, ובמקום זאת מיקם את מקבל האלקטרונים באתר הקישור לאוביקווינול של קומפלקס III. מחקר שלישי מצא שריכוזים נמוכים העלו את צריכת החמצן במנוחה, אך לא שינו את הנשימה המוגברת בעקבות ADP. הניסוח הישיר ביותר של הנקודה הוא שצריכת החמצן המושרית על ידי מתילן כחול אינה תלויה כלל בזרחון חמצוני: היא נמשכה כאשר שרשרת הנשימה עוכבה, וגם בתכשירים שלא הייתה בהם שרשרת כזאת.

קיימות גם מדידות ישירות של הפער בין שתי הכמויות. במיטוכונדריות מבודדות מכבד חולדה, העלאת ריכוזי הצבע הפחיתה את יחסי הבקרה הנשימתית וגרמה להתנפחות, שהמחברים תיארו כניתוק הצימוד בזרחון חמצוני. בכבד חולדה שעבר זילוח, מתילן כחול העלה את צריכת החמצן בעוד שהיחס בין ATP ל־ADP ירד.

גם התיעוד הקליני מעביר אותו מסר. במתהמוגלובינמיה מטפלים באמצעות כמיליגרם אחד עד שניים של מתילן כחול לקילוגרם במתן תוך־ורידי, דרך מסלול חיזור התלוי ב־NADPH, ומינונים גדולים יותר גורמים למצב שאותו מבקשים לטפל בו. אותה סקירה מציינת שההשפעה כנוגדן רעל מרבית בתאי דם אדומים שלמים ופוחתת בנוכחות המוליזה — ממצא ההמוליזה משנת 1930 שב ומופיע כעבור שבעים ושלוש שנים בהקשר בית־חולים. תרכובת שהשפעותיה המועילות והמזיקות נמצאות משני צדיו של סף מינון אינה תרכובת שיש להסיק את המינון שלה ממדידת צריכת חמצן.

מדוע האצווה שייכת לדיון

הארופ ובארון הבחינו בדבר הראוי לקריאה נוספת. מתילן כחול עצמו יוצר בספקטרוסקופ פס בין שני הפסים האופייניים למתהמוגלובין, "העלול בקלות לגרום לבלבול בבדיקה שטחית". הצבע יכול לחקות את החומר שמחפשים.

לאותה בעיה יש גם ביטוי כימי. לפנותיאזין קשור, הנמצא כרכיב משני, יש התנהגות חמצון־חיזור משלו, חדירות משלו ורעילות משלו. מקרה מתועד אחד ממחיש את המשמעות: במחקר על יודינציה של מתילן כחול, דגימות שהכילו כ־7 עד 8 אחוזים Azure B יצרו בעיקר Azure B שעבר יודינציה, כך שהזיהום, ולא המתילן הכחול, הוא ששלט בתגובה.

כל מי שמשתמש במתילן כחול כריאגנט — במעבדה, בעמדת צביעה או באקווריום — עובד עם חומר שהרכבו אינו מוגדר, אלא אם האצווה אופיינה. חומרים קשורים, זהות החומר, זיהומים יסודיים, ממסים שיוריים ושארית לאחר הצתה הם חלק מהניסוי, ולא ניירת שמסביבו. Blupreme רוכשת את המתילן הכחול שלה מיצרן תרופות ומפרסמת תעודת אנליזה מלאה, תוך בדיקה של מפרט USP כולו ולא של מתכות כבדות בלבד; המדריך לקריאת תעודת אנליזה ומה הסיווג בדרגת USP מבסס ומה אינו מבסס מסבירים כיצד לבדוק את המסמך מול הטענה.

המספר היה נכון

הניסויים של 1928 ו־1930 היו קפדניים, והתצפית המרכזית שלהם עמדה במבחן הזמן: צבע הניתן לחיזור יכול לגרום לתא שכמעט אינו נושם לצרוך חמצן בקצב הגבוה פי כמה וכמה מקצבו במנוחה, בלי לעבור דרך השלב שציאניד חוסם.

הטעות מופיעה מאוחר יותר, כשקוראים את המילה "נשימה" במשמעותה המודרנית. מדידה של חילופי גזים מלמדת שאלקטרונים הגיעו לחמצן. היא אינה מלמדת שאחד מהם שימש לייצור ATP, ובתא ללא מיטוכונדריות הפער בין שתי האמירות האלה גדול ככל האפשר. המיפוי הרחב יותר של פעולות המתילן הכחול בתאים מציב את אותה הבחנה במסגרת רחבה יותר, ותולדות התרכובת, מצבע לתרופה מסבירות כיצד חומר לצביעת טקסטיל הגיע מלכתחילה לניסויים האלה.