A historia do azul de metileno: do colorante á medicina e á investigación

O azul de metileno chegou a un paciente antes de chegar a unha farmacia.

O informe de 1891 de Paul Guttmann e Paul Ehrlich sobre o uso do colorante na malaria contén dous gráficos de temperatura. O segundo abrangue do 13 de xullo ao 5 de agosto, co tratamento anotado na marxe día a día. As entradas do 18 e 19 de xullo din "1 × 0,05 Methylenblau". Nos días seguintes figuran cinco e sete doses da mesma cantidade e, para o 22 de xullo, engadírase ao rexistro unha pequena cantidade de quinina. A liña da febre, que oscila entre 37 °C e 39.5 °C durante a primeira metade do gráfico, aplánase despois de aparecer o colorante e mantense entre aproximadamente 36 °C e 37.5 °C durante as tres semanas restantes.

O paciente era un de dous, descritos no artigo como un criado doméstico e un mariñeiro. O composto que recibiron levaba quince anos sendo un colorante téxtil comercial, e os dous homes están entre as primeiras persoas das que consta que foron tratadas cun fármaco totalmente sintético dirixido contra un organismo específico.

Primeiro veu o colorante

O primeiro colorante sintético que acadou éxito comercial foi creado por William Henry Perkin en 1856. Perkin tiña dezaoito anos, traballaba nun laboratorio doméstico durante unhas vacacións de Pascua e intentaba sintetizar quinina. En vez diso obtivo un residuo negro, disolveuno e atopou unha cor que se fixaba de maneira brillante á seda. Patentouna en agosto de 1856 e, a finais de 1857, xa tiña unha fábrica que fornecía unha tinturaría de seda de Londres.

En 1875 Adolf von Baeyer sintetizou un colorante vermello e chamoulle eosina, de Eos, a palabra grega para a alba. En 1876 Heinrich Caro, daquela director do laboratorio da Badische Anilin- und Soda-Fabrik, desenvolveu o azul de metileno con Baeyer como un colorante de base anilínica para algodón. A súa estrutura química non quedou establecida ata aproximadamente nove anos despois.

Esa orixe segue sendo visible na maneira en que se denomina a substancia. "Azul de metileno" é un nome comercial procedente do catálogo de colorantes, non unha descrición química. O composto ao que se refire é o cloruro de metiltioninio, e as diferenzas entre o nome, o sal e os seus hidratos importan en canto alguén pesa o material ou le unha especificación.

A tinción foi a ponte

O camiño desde a fábrica de colorantes ata o hospital pasou polo microscopio, e comezou antes de que existise o azul de metileno. Wilhelm Erb foi a primeira persoa en aplicar un colorante sintético ao sangue, utilizando ácido pícrico en 1865, e observou un patrón reticular no interior dalgúns glóbulos vermellos.

A tese de doutoramento de Paul Ehrlich de 1878 comparaba a tinción histolóxica coa tinguidura de tecidos e defendía que ambas eran reaccións químicas. Traballando baixo a dirección de Robert Koch co bacilo da tuberculose, clasificou os colorantes de anilina en clases ácidas e básicas e estableceu que cada clase coloreaba partes distintas dunha célula. En 1880 mesturou ambas: unha solución saturada de azul de metileno vertida en fucsina ácida ata que o sobrenadante quedou transparente. O resultado, ao que chamou neutralen Farbkörper ou tinción neutra, producía tres cores en vez dunha, revelou gránulos nas células polimorfonucleares que non foran visibles antes e fixo posible o primeiro reconto diferencial de leucocitos. Como eses gránulos captaban ambos compoñentes da mestura, Ehrlich acuñou a palabra neutrófilo para as células que os contiñan.

Dous anos despois Koch utilizou azul de metileno para localizar o bacilo da tuberculose e, en 1883, Ehrlich mellorou o método. En 1886 publicou outro tipo de observación: inxectou o colorante en animais vivos e comparou a intensidade coa que cada órgano o captaba, e concluíu que tiña unha afinidade marcada polo cerebro e o tecido nervioso. Atribuíu esa afinidade ao ciclo de oxidación-redución do colorante, que observara o ano anterior. Ese ciclo tamén explica por que unha solución de azul de metileno perde a súa cor cando se consume o seu osíxeno e a recupera cando volve entrar aire. Os experimentos que mediron por primeira vez as consecuencias dese ciclo pertencen a unha década posterior, e o mecanismo en si é un asunto distinto da historia.

O parasito e o núcleo púrpura

Alphonse Laveran atopou o parasito da malaria en 1880 examinando sangue fresco sen tinguir. Para velo de maneira habitual nun frotis seco facía falta unha tinción, e as tincións daquela só producían vermello e azul.

En 1888 o patólogo polaco Czesław Cheçinski substituíu a fucsina ácida por eosina, creando unha mestura de azul de metileno e eosina. O caso no que baseou o seu método foi o dun soldado que morrera de malaria o 30 de setembro de 1887. Nas extensións de sangue, Cheçinski viu formas azuis semellantes a margaridas, hoxe recoñecidas como Plasmodium malariae, e formas falciformes, hoxe recoñecidas como os gametocitos de Plasmodium falciparum. O resultado puxo fin ao mesmo tempo a dúas explicacións rivais da enfermidade: a teoría do miasma e a afirmación de Edwin Klebs e Corrado Tommasi-Crudeli de que a malaria estaba causada por unha bacteria.

O parasito era visible. O seu núcleo non, o que deixaba aberta a cuestión da súa natureza. Ernst Malachowski, médico en Breslau, resolveu ese problema primeiro por accidente e despois deliberadamente. En 1889 observou unha tinción diferencial do núcleo do plasmodio nunha preparación e non conseguiu reproducila. Acidificar o azul de metileno non serviu. Alcalinizalo con bórax producía o efecto todas as veces. Demostrou a técnica publicamente o 15 de xuño de 1890 e publicouna ese mesmo ano, cun método máis detallado en agosto de 1891.

Dmitri Romanowsky publicou a súa propia versión en setembro de 1891. Os seus mellores resultados procederon dunha botella descoidada e con mofo dunha solución de azul de metileno de máis de dous meses. O procedemento de Malachowski era deliberado e, segundo as súas palabras, facilmente reproducible; o de Romanowsky foi unha vía morta que funcionou unha vez. Aínda así, o epónimo quedou para Romanowsky, e a disputa sobre quen produciu o púrpura que fixo visible o núcleo é outra historia, cos seus propios documentos.

Figura: o segundo gráfico de temperatura do informe de Guttmann e Ehrlich de 1891. O panel superior abrangue do 13 ao 24 de xullo e o inferior do 25 de xullo ao 5 de agosto; as anotacións da marxe indican as doses administradas, e a temperatura mantense próxima ao normal durante as tres últimas semanas do rexistro. Reproducido do informe tal como foi dixitalizado para Krafts, Hempelmann e Skórska-Stania, Parasitology Research* 111:1–6 (2012), PMID 22411634.

A maduración resultou ser desmetilación

Ninguén implicado na década de 1890 sabía que facía a "maduración" ao azul de metileno. A resposta chegou da química industrial. Heinrich August Bernthsen sintetizara o composto proxenitor fenotiazina en 1883, estableceu en 1885 que o azul de metileno pertencía a esa familia e demostrou no mesmo período que as condicións alcalinas eliminan grupos metilo do colorante, producindo os compostos que hoxe se denominan azures.

Bernard Nocht extraeu a fracción activa en 1898 e 1899 e só puido chamala Rot aus Methylenblau, vermello procedente do azul de metileno. Michaelis identificouna como azure I en 1901. Jenner introduciu metanol absoluto como disolvente para o precipitado do colorante en 1899, o que eliminou a necesidade de fixar con calor as extensións de sangue; Leishman e Reuter combinaron ambos avances; Wright publicou un método simplificado en 1902. A contribución de Giemsa, tamén en 1902, consistiu en deixar de depender dunha solución madurada ao azar e utilizar no seu lugar cantidades medidas de colorantes coñecidos. Despois negouse a publicar como producía azul de metileno azure puro e vendeu o método ao laboratorio do Dr. Grübler, que comercializou o produto como azure I e afirmou que só a súa versión era unha tinción de Giemsa auténtica.

Dúas guerras mundiais remataron o traballo por accidente. Cando os colorantes alemáns deixaron de estar dispoñibles, Lillie, Roe e Wilcox traballaron cos substitutos estadounidenses e descubriron que a mellor tinción procedía de tres compoñentes separados: azul de metileno puro, o seu produto de degradación azure B e eosina. Eses tres seguen sendo os principais compoñentes da tinción utilizada hoxe para diagnosticar a malaria, baixo un nome que agora reúne Malachowski, Wright e Giemsa.

Figura: formas en anel de Plasmodium falciparum* en glóbulos vermellos humanos, tinguidas cun método de tipo Romanowsky. A estrutura púrpura no interior do anel é a cromatina que o azul de metileno tratado con bórax de Malachowski fixo visible por primeira vez. Imaxe de Ernst Hempelmann, publicada no dominio público.

Un nome, varios materiais

Os anos que separaron eses compoñentes deixaron un problema que sobreviviu á propia química. Ralph Lillie trazou en 1969 a fronteira entre as tincións biolóxicas, "fabricadas segundo especificacións ríxidas acordes cos seus usos delicados e esixentes", e as tincións non biolóxicas para tinguidura téxtil, que "requieren normas de fabricación menos rigorosas e esixentes". Ambos tipos de produto levaban o mesmo nome, e a diferenza entre eles nunca foi unha diferenza de grao. Unha especificación redactada para algodón e unha especificación redactada para un reactivo diagnóstico non son intercambiables, e un material fabricado segundo a especificación téxtil non estaba destinado a ser inxerido.

Azure B é a ilustración máis clara. É a forma monodesmetilada do azul de metileno, ten unha actividade farmacolóxica propia medible e estivo presente como compoñente non controlado das preparacións clínicas de azul de metileno durante máis dun século antes de que alguén separase ambos. Un grupo descubriu que o tecido humano obtido en autopsias tras a administración de azul de metileno contiña entre un 5 e un 14 por cento de azul de metileno sen modificar e entre un 86 e un 95 por cento de azure B. Se unha preparación determinada debe conter azure B, e con que límite, é unha cuestión de especificación, e a investigación sobre azure B como impureza e metabolito continúa a partir de aí.

Nunha especificación tamén reside a consecuencia práctica. A conformidade coa USP é a vía cara á maior pureza que ofrece o mercado, porque é unha norma de ensaio publicada e completa, non unha única medición. Abarca identidade, ensaio, impurezas orgánicas incluídos os colorantes azure, disolventes residuais, impurezas elementais, residuo de ignición, límites microbianos e endotoxinas bacterianas. Un certificado que informa dun resultado de metais pesados e o denomina conformidade coa USP só informou dunha liña desa lista.

Blupreme obtén o seu azul de metileno dun fabricante farmacéutico e publica o certificado de análise completo, comprobando toda a especificación USP en vez de só os metais pesados. A guía para ler un certificado de análise e o que a designación USP establece e o que non explican como comprobar o documento fronte á afirmación.

O que a historia permite afirmar, e o que non

A liñaxe é real e máis longa do que suxiren a maioría das páxinas de produto. O azul de metileno utilizouse para tratar a malaria en 1891, foi descrito como sedante na psicose con axitación en 1899 e a súa cadea lateral esténdese a través da quinacrina, a cloroquina, a prometazina e a clorpromazina. O artigo de Ehrlich de 1890 con Arthur Leppmann describiu alivio da dor neurálxica e reumática e, despois, considerou e descartou probar o colorante en enfermidades mentais.

Nada diso establece un uso moderno. O resultado sobre malaria de 1891 consistía en dous pacientes e un gráfico de temperatura. Unha longa familiaridade cunha molécula é un motivo para estudala, non un resultado. A historia do composto como fármaco e os ensaios modernos sobre malaria responden a preguntas distintas das que formulaba Ehrlich, e os criterios de valoración deben interpretarse nos seus propios termos.

Hai un detalle no rexistro que pertence ao presente máis ca ao pasado. Cando os investigadores realizaron ensaios de azul de metileno contra a malaria en Burkina Faso na década de 2000, atopáronse competindo por material de grao farmacéutico e informaron de que o prezo da materia prima aumentara nun factor de aproximadamente cen unha vez que contaba con validación GMP. Un colorante podía substituírse. Un fármaco non. A distinción que Lillie trazou en 1969 é a mesma que determina o que contén unha botella hoxe.