Como funciona o azul de metileno? Química redox e mecanismos

Un matraz con tapón sobre unha bancada é a introdución honesta máis breve a como funciona o azul de metileno. Auga, glicosa, unha pequena cantidade de hidróxido de sodio e suficiente colorante para converter o líquido nun azul intenso e inconfundible. Agárdanse uns minutos e o azul desaparece ata que o matraz parece conter só auga. Axítase e a cor reaparece de inmediato. Despois volve desaparecer, e seguirá facéndoo mentres haxa glicosa disposta a ceder electróns e osíxeno disposto a aceptalos.

Nada cambiou no colorante salvo o número de electróns que transporta. Oxidado, é azul. Reducido, non o é. Case todo o demais na literatura terapéutica e de investigación sobre esta molécula deriva dese único paso reversible, porque unha molécula capaz de tomar electróns dun participante e entregalos a outro é un relé, e un relé non fai nada por si só. O que fai depende por completo do que se atope en cada un dos seus extremos.

Dúas formas e por que importa o par

A forma oxidada é un sistema de aneis plano e con carga positiva. Esa forma plana e cargada explica por que se apila contra os ácidos nucleicos, por que se une a estruturas sialiladas das membranas celulares e por que absorbe intensamente luz visible entre aproximadamente 600 e 700 nanometres, que corresponde á parte do espectro que o ollo humano percibe como azul.

A forma reducida é diferente. Non ten carga, disólvese en graxa en lugar de en auga e é incolora. A súa ionización é moi baixa ao pH do interior do corpo, da orde dun poucos per cent. Por iso, a molécula reducida atravesa facilmente unha membrana celular por difusión e, unha vez dentro, onde o ambiente é máis oxidante, pode volver oxidarse e quedar efectivamente atrapada. O sistema de aneis oxidado é plano; o reducido pode retorcerse. Esas consecuencias estruturais, e o propio cambio de cor, forman parte da historia das dúas formas por dereito propio e explícanse con máis detalle na comparación entre o azul de metileno e o azul de leucometileno.

Aceptación de electróns

O colorante oxidado acepta electróns dunha ampla variedade de doadores. A glicosa do matraz da demostración é un deles. Dentro dunha célula, os nucleótidos de piridina reducidos e os compoñentes da cadea mitocondrial de transporte de electróns son outros. Cando o azul de metileno se reduce nun tecido que contén osíxeno, o ciclo que establece consome tanto o axente redutor como o osíxeno e produce especies reactivas do osíxeno, principalmente peróxido de hidróxeno. O colorante sae de novo do ciclo sen cambios, listo para repetilo.

Este último punto explica unha contradición que, doutro xeito, podería parecer descoidada. Na literatura, o azul de metileno descríbese tanto como prooxidante como antioxidante, e ambas descricións son defendibles. Pode reducir a produción de superóxido actuando como aceptor artificial de electróns e desviando o fluxo de electróns dos sitios enzimáticos nos que, doutro xeito, o osíxeno se convertería en radicais superóxido. En cultivos de células hepáticas demostrouse que induce encimas antioxidantes de defensa de fase 2, entre eles a tiorredoxina redutase 1 e a NADPH quinona oxidorredutase. Cal das dúas facetas se observa depende de que extremo do relé teña escaseza de electróns nese momento. Unha pregunta como "é o azul de metileno un antioxidante" non está ben formulada ata especificar en que sistema, a que concentración e con que outros elementos presentes.

Cesión dos electróns

Unha vez que o colorante retén un electrón sobrante, poden ocorrer tres cousas moi diferentes, que adoitan describirse baixo un mesmo epígrafe. Non deberían.

Pode transferir o electrón a un centro metálico. O caso máis claro é a hemoglobina que se oxidou do estado ferroso ao férrico. Nese estado non pode transportar osíxeno. Nos glóbulos vermellos, un encima reduce o colorante e o colorante reducido transfire despois electróns de maneira non enzimática ao ferro do hemo oxidado, restaurando a hemoglobina funcional e devolvendo o colorante á súa forma oxidada. O colorante non se consome neste proceso; entra nun ciclo. O contexto clínico baseado nesta reacción é unha cuestión hospitalaria, e a explicación do azul de metileno na metahemoglobinemia describe como se utiliza e por que require unha supervisión tan estreita.

Unha nota necesaria sobre as fontes: as dúas revisións nas que se basea este artigo non indican o mesmo cofactor redutor para o paso enzimático; unha sinala NADH e a outra NADPH. A discrepancia é real e non está resolta nas fontes dispoñibles aquí, polo que a descrición máis segura consiste en explicar a función de cada compoñente en lugar de atribuír un único cofactor.

Pode transferir enerxía, ou un electrón, ao osíxeno se hai luz. Esta vía só existe baixo iluminación. O colorante excitado alcanza un estado triplete e, a partir de aí, son posibles dous mecanismos. No primeiro, o colorante excitado interactúa directamente cunha molécula próxima, retirándolle un hidróxeno ou transferindo un electrón, o que xera radicais; a reacción coa auga por esta vía produce radicais hidroxilo. No segundo, a enerxía de excitación transfírese ao propio osíxeno, producindo osíxeno singlete, unha especie altamente electrofílica que decae en microseconds e que se acepta en xeral como a principal vía pola que o azul de metileno iluminado dana as células microbianas. Entre os resultados documentados están as reaccións cos lípidos e péptidos da envoltura celular e coas bases de guanina do ADN.

A consecuencia práctica desta vía é que a iluminación modifica os valores en ordes de magnitude. Nos datos recompilados por Wainwright e Crossley, o azul de metileno contra Pseudomonas aeruginosa presenta unha concentración bactericida mínima duns 500 micromolar na escuridade e duns 25 micromolar baixo unha dose de luz de 12 joules per square centimetre. Contra unha cepa de Staphylococcus aureus, os valores na escuridade e con iluminación son ambos de 5 micromolar. Noutras palabras, que a molécula poida considerarse antimicrobiana non é unha propiedade exclusiva da molécula; é unha propiedade da molécula xunto coa luz.

Pode actuar directamente nun sitio enzimático, sen o relé. O azul de metileno oxida o ferro ferroso unido á sintase de óxido nítrico, o que inactiva o encima. Bloquea a guanilato ciclase soluble, e entre 1 e 10 micromolar é a concentración de laboratorio utilizada habitualmente para ese propósito. Inhibe a monoamino oxidase tipo A cun IC50 entre 27 e 180 nanomolar, que é o mecanismo que explica a interacción ben documentada cos inhibidores da recaptación de serotonina e a razón pola que as interaccións farmacolóxicas do azul de metileno constitúen unha categoría propia.

Estas tres vías son quimicamente distintas. Reducilas a unha única afirmación de que o azul de metileno funciona mediante ciclos redox é a principal razón pola que tantos textos sobre el resultan ao mesmo tempo seguros no ton e vagos no contido.

Catro distincións que determinan se unha afirmación mecanística significa algo

Que forma. O colorante reducido non é intercambiable co colorante oxidado. A inhibición da acetilcolinesterase ilustra o problema: nunha incubación longa in vitro, o azul de metileno redúcese progresivamente á súa forma incolora e a inhibición diminúe, porque a molécula reducida non inhibe ese encima. Un ensaio suficientemente prolongado como para cambiar a forma rexistrará un efecto máis débil e favorecerá unha explicación incorrecta.

Que concentración. O intervalo de laboratorio para a inhibición da guanilato ciclase soluble é de 1 a 10 micromolar. Eliminar a transmisión mediada polo glutamato en cortes de hipocampo de rata requiriu de 5 a 50 micromolar. En cultivo celular descríbense efectos tóxicos por riba de 100 micromolar. Non se trata do mesmo experimento, e un mecanismo confirmado a 50 micromolar non está automaticamente dispoñible nun paciente cuxa concentración plasmática sexa unha fracción dese valor.

Que vía. A biodispoñibilidade oral absoluta é de arredor do 72 per cent, e a semivida plasmática terminal é de 5 a 7 hours. A administración oral produce concentracións máis altas no intestino e no fígado; a administración intravenosa produce concentracións máis altas no cerebro. A vía determina que tecido entra en contacto cos electróns.

Que modelo e se as luces estaban acesas. Gran parte da literatura mecanística procede de cultivos celulares e estudos en roedores, e os resultados in vitro con esta molécula dependen da exposición á luz, do potencial de membrana e do estado redox das células, porque a luz dun microscopio é suficiente para fotosensibilizala. Entre o 65 e o 85 per cent dunha dose administrada redúcese á forma incolora nos glóbulos vermellos e no tecido periférico. Cada unha desas variables sitúase entre un mecanismo claro observado nunha placa e unha afirmación sobre unha persoa.

Por que a cuestión da pureza é unha cuestión química

A iluminación desmetila o azul de metileno. O primeiro produto é Azure B, despois Azure A e despois tionina, e unha intensidade luminosa maior produce máis degradación ca unha menor. Polo tanto, unha molécula cuxa utilidade consiste en poder aceptar e ceder electróns é tamén unha molécula cuxos produtos probables de degradación son parentes químicos próximos que permanecen na mesma solución. A composición do contido do recipiente non é un detalle cosmético.

Esa é a razón pola que a conformidade coa especificación USP é a proba relevante para un comprador. Un produto que non a cumpra é un colorante, e un colorante pode conter impurezas, entre elas Azure B, metais pesados e disolventes residuais, que unha persoa non quere inxerir. Outro problema é o vendedor que analiza unicamente os metais pesados e presenta o resultado como se demostrase o cumprimento completo. Blupreme asociouse cun fabricante farmacéutico de azul de metileno e analiza a especificación completa: identidade, pureza, impurezas orgánicas, disolventes residuais, impurezas elementais, residuo de ignición, límites microbiolóxicos e endotoxinas bacterianas. Publícase o documento de análises de laboratorio correspondente a cada lote, e escoller un provedor consiste en boa medida en comprobar se ese documento existe e que aspectos abrangue.

Un par reversible. Varias vías a partir del. A vía determina o que pode afirmarse.