L’histoire du bleu de méthylène : du colorant au médicament et à la recherche

Le bleu de méthylène a atteint un patient avant d’atteindre une pharmacie.

Le rapport de 1891 de Paul Guttmann et Paul Ehrlich sur l’utilisation du colorant contre le paludisme contient deux courbes de température. La seconde s’étend du 13 juillet au 5 août, avec le traitement inscrit dans la marge jour après jour. Les entrées des 18 et 19 juillet indiquent « 1 × 0,05 Methylenblau ». Les jours suivants mentionnent cinq et sept doses de la même quantité, et, le 22 juillet, une petite quantité de quinine apparaît également dans le relevé. La courbe de fièvre, qui oscille entre 37 °C et 39.5 °C pendant la première moitié du graphique, s’aplatit après l’apparition du colorant et reste entre environ 36 °C et 37.5 °C durant les trois semaines restantes.

Le patient était l’un des deux hommes décrits dans l’article, l’un comme domestique et l’autre comme marin. Le composé qu’ils avaient reçu était un colorant textile commercial depuis quinze ans, et ces deux hommes comptent parmi les premières personnes recensées comme ayant été traitées avec un médicament entièrement synthétique ciblant un organisme précis.

Le colorant est venu en premier

Le premier colorant synthétique ayant connu un succès commercial a été créé par William Henry Perkin en 1856. Perkin avait dix-huit ans, travaillait dans un laboratoire installé chez lui pendant les vacances de Pâques et tentait de synthétiser de la quinine. Il obtint à la place un résidu noir, le dissolut et découvrit une couleur qui se fixait avec éclat sur la soie. Il la breveta en août 1856 et, à la fin de 1857, possédait une usine approvisionnant une teinturerie de soie londonienne.

En 1875, Adolf von Baeyer synthétisa un colorant rouge et le nomma éosine, d’après Eos, le mot grec désignant l’aube. En 1876, Heinrich Caro, alors directeur du laboratoire de la Badische Anilin- und Soda-Fabrik, développa avec Baeyer le bleu de méthylène comme colorant à base d’aniline pour le coton. Sa structure chimique ne fut établie qu’environ neuf ans plus tard.

Cette origine reste visible dans la manière dont la substance est nommée. « Bleu de méthylène » est un nom commercial issu du catalogue des colorants, et non une description chimique. Le composé auquel il fait référence est le chlorure de méthylthioninium, et les distinctions entre le nom, le sel et ses hydrates deviennent importantes dès que l’on pèse la substance ou que l’on lit une spécification.

La coloration a servi de passerelle

Le passage des ateliers de teinture à l’hôpital s’est fait par le microscope, et il a commencé avant même l’existence du bleu de méthylène. Wilhelm Erb fut le premier à appliquer un colorant synthétique au sang, en utilisant de l’acide picrique en 1865, et observa une structure réticulaire à l’intérieur de certains globules rouges.

La thèse de doctorat de Paul Ehrlich, publiée en 1878, comparait la coloration histologique à la teinture des textiles et soutenait que les deux étaient des réactions chimiques. En travaillant sous la direction de Robert Koch sur le bacille de la tuberculose, il classa les colorants d’aniline en catégories acides et basiques et établit que chaque catégorie colorait différentes parties d’une cellule. En 1880, il mélangea les deux : une solution saturée de bleu de méthylène versée dans de la fuchsine acide jusqu’à clarification du surnageant. Le résultat, qu’il appela neutralen Farbkörper, ou coloration neutre, produisait trois couleurs au lieu d’une, révélait dans les cellules polymorphonucléaires des granulations jusque-là invisibles et rendait possible la première numération différentielle des leucocytes. Comme ces granulations absorbaient les deux composants du mélange, Ehrlich créa le terme neutrophile pour désigner les cellules qui les portaient.

Deux ans plus tard, Koch utilisa le bleu de méthylène pour détecter le bacille de la tuberculose, et, en 1883, Ehrlich améliora la méthode. En 1886, il publia une observation d’un autre type : il injecta le colorant à des animaux vivants, compara l’intensité avec laquelle chaque organe l’absorbait et conclut qu’il présentait une affinité marquée pour les tissus cérébraux et nerveux. Il attribua cette affinité au cycle d’oxydoréduction du colorant, qu’il avait observé l’année précédente. Ce cycle explique également pourquoi une solution de bleu de méthylène perd sa couleur lorsque son oxygène est consommé et la retrouve lorsque l’air revient. Les expériences qui ont mesuré pour la première fois les conséquences de ce cycle appartiennent à une décennie ultérieure, et le mécanisme lui-même constitue un sujet distinct de l’histoire.

Le parasite et le noyau violet

Alphonse Laveran découvrit le parasite du paludisme en 1880 en examinant du sang frais non coloré. Pour l’observer régulièrement dans un frottis séché, une coloration était nécessaire, et les colorations de l’époque ne produisaient que du rouge et du bleu.

En 1888, le pathologiste polonais Czesław Cheçinski remplaça la fuchsine acide par de l’éosine, obtenant un mélange de bleu de méthylène et d’éosine. Le cas à l’origine de sa méthode concernait un soldat mort du paludisme le 30 septembre 1887. Dans les frottis sanguins, Cheçinski observa des formes bleues évoquant des marguerites, aujourd’hui reconnues comme Plasmodium malariae, ainsi que des formes en faucille, aujourd’hui reconnues comme les gamétocytes de Plasmodium falciparum. Ce résultat mit simultanément fin à deux explications concurrentes de la maladie : la théorie des miasmes et l’affirmation d’Edwin Klebs et Corrado Tommasi-Crudeli selon laquelle le paludisme était causé par une bactérie.

Le parasite était visible. Son noyau ne l’était pas, ce qui laissait sa nature indéterminée. Ernst Malachowski, médecin à Breslau, résolut ce problème d’abord par accident, puis délibérément. En 1889, il remarqua une coloration différentielle du noyau du plasmodium dans une préparation, mais ne parvint pas à la reproduire. L’acidification du bleu de méthylène n’eut aucun effet. Son alcalinisation avec du borax produisit l’effet à chaque fois. Il présenta publiquement la technique le 15 juin 1890 et la publia la même année, puis décrivit une méthode plus complète en août 1891.

Dmitri Romanowsky publia sa propre version en septembre 1891. Ses meilleurs résultats provenaient d’un flacon négligé et moisi contenant une solution de bleu de méthylène vieille de plus de deux mois. La méthode de Malachowski était délibérée et, selon ses propres termes, facilement reproductible ; celle de Romanowsky constituait une impasse qui avait fonctionné une fois. L’éponyme revint néanmoins à Romanowsky, et la controverse sur l’identité de celui qui produisit le violet rendant le noyau visible constitue une histoire distincte, documentée par ses propres sources.

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Figure :** la seconde courbe de température du rapport de Guttmann et Ehrlich de 1891. Le panneau supérieur couvre la période du 13 au 24 juillet et le panneau inférieur celle du 25 juillet au 5 août ; les entrées en marge indiquent les doses administrées, et la température reste proche de la normale pendant les trois dernières semaines du relevé. Reproduit à partir du rapport tel que numérisé pour Krafts, Hempelmann et Skórska-Stania, Parasitology Research 111:1–6 (2012), PMID 22411634.

La maturation s’est révélée être une déméthylation

Personne, dans les années 1890, ne savait ce que la « maturation » faisait au bleu de méthylène. La réponse est venue de la chimie industrielle. Heinrich August Bernthsen avait synthétisé en 1883 le composé parent, la phénothiazine, établi en 1885 que le bleu de méthylène appartenait à cette famille et montré, durant la même période, que les conditions alcalines retiraient des groupes méthyle du colorant, produisant les composés aujourd’hui appelés azures.

Bernard Nocht isola la fraction active en 1898 et 1899 et ne put que la nommer Rot aus Methylenblau, rouge issu du bleu de méthylène. Michaelis l’identifia comme azure I en 1901. Jenner introduisit en 1899 le méthanol absolu comme solvant du précipité de colorant, supprimant ainsi la nécessité de fixer les frottis sanguins par chauffage ; Leishman et Reuter combinèrent les deux avancées ; Wright publia une méthode simplifiée en 1902. La contribution de Giemsa, également en 1902, fut de cesser de dépendre d’une solution ayant mûri de manière aléatoire et d’utiliser à la place des quantités mesurées de colorants connus. Il refusa ensuite de publier sa méthode de fabrication de l’azure de méthylène pur et vendit le procédé au laboratoire du Dr Grübler, qui commercialisa le produit sous le nom d’azure I et affirma que seule sa version constituait une authentique coloration de Giemsa.

Deux guerres mondiales achevèrent le processus par accident. Lorsque les colorants allemands devinrent impossibles à obtenir, Lillie, Roe et Wilcox étudièrent les substituts américains et constatèrent que la meilleure coloration provenait de trois composants séparés : du bleu de méthylène pur, son produit de dégradation azure B, et de l’éosine. Ces trois substances restent les principaux composants de la coloration utilisée aujourd’hui pour diagnostiquer le paludisme, sous un nom qui associe désormais Malachowski, Wright et Giemsa.

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Figure :** formes annulaires de Plasmodium falciparum dans des globules rouges humains, colorées selon une méthode de type Romanowsky. La structure violette à l’intérieur de l’anneau correspond à la chromatine que le bleu de méthylène traité au borax de Malachowski rendit visible pour la première fois. Image d’Ernst Hempelmann, placée dans le domaine public.

Un seul nom, plusieurs matériaux

Les années nécessaires pour séparer ces composants ont laissé un problème qui a survécu à la chimie. Ralph Lillie établit en 1969 une distinction entre les colorants biologiques, « fabriqués selon des spécifications strictes adaptées à leurs usages délicats et exigeants », et les colorants non biologiques destinés à la teinture textile, qui « exigent des normes de fabrication moins rigoureuses et moins contraignantes ». Les deux types de produits portaient le même nom, et leur différence n’a jamais été une simple question de degré. Une spécification rédigée pour le coton et une spécification rédigée pour un réactif diagnostique ne sont pas interchangeables, et un matériau fabriqué selon la première n’était pas destiné à être avalé.

Azure B en est l’illustration la plus claire. Il s’agit de la forme monodéméthylée du bleu de méthylène, il possède une activité pharmacologique mesurable qui lui est propre et il a été présent comme constituant non contrôlé des préparations cliniques de bleu de méthylène pendant plus d’un siècle avant que les deux ne soient séparés. Un groupe a constaté que des tissus humains prélevés lors d’autopsies après administration de bleu de méthylène contenaient 5 à 14 pour cent de bleu de méthylène inchangé et 86 à 95 pour cent d’azure B. La question de savoir si une préparation donnée doit contenir de l’azure B, et dans quelle limite, relève de la spécification, et les recherches sur l’azure B comme impureté et métabolite reprennent le sujet à partir de là.

C’est également dans la spécification que se trouve la conséquence pratique. La conformité USP est la voie vers la pureté la plus élevée proposée sur le marché, car il s’agit d’une norme d’essai publiée complète plutôt que d’une mesure unique. Elle couvre l’identité, le dosage, les impuretés organiques, y compris les colorants azurés, les solvants résiduels, les impuretés élémentaires, le résidu à l’incinération, les limites microbiennes et les endotoxines bactériennes. Un certificat qui indique un résultat pour les métaux lourds et le présente comme une conformité USP ne rapporte qu’une seule ligne de cette liste.

Blupreme obtient son bleu de méthylène auprès d’un fabricant pharmaceutique et publie le certificat d’analyse complet, en testant l’ensemble de la spécification USP plutôt que les seuls métaux lourds. Le guide de lecture d’un certificat d’analyse et ce que la désignation USP établit ou n’établit pas expliquent comment vérifier le document par rapport à l’affirmation.

Ce que l’histoire permet d’affirmer, et ce qu’elle ne permet pas

La filiation historique est réelle, et elle est plus longue que ne le laissent entendre la plupart des pages produit. Le bleu de méthylène a été utilisé pour traiter le paludisme en 1891, a été décrit comme sédatif dans la psychose agitée en 1899, et sa chaîne latérale se retrouve dans la quinacrine, la chloroquine, la prométhazine et la chlorpromazine. L’article de 1890 d’Ehrlich avec Arthur Leppmann décrivait un soulagement des douleurs névralgiques et rhumatismales, puis envisageait avant de renoncer à tester le colorant dans les maladies mentales.

Rien de cela n’établit un usage moderne. Le résultat de 1891 sur le paludisme reposait sur deux patients et une courbe de température. Une longue familiarité avec une molécule constitue une raison de l’étudier, pas un résultat. L’histoire du composé comme médicament et les essais modernes sur le paludisme répondent à des questions différentes de celles qu’Ehrlich posait, et leurs critères d’évaluation doivent être interprétés selon leurs propres termes.

Un détail du dossier appartient au présent plutôt qu’au passé. Lorsque des chercheurs ont mené des essais sur le bleu de méthylène contre le paludisme au Burkina Faso dans les années 2000, ils se sont retrouvés en concurrence pour obtenir du matériau de qualité pharmaceutique et ont indiqué que le prix de la matière première avait augmenté d’un facteur d’environ cent une fois assortie d’une validation GMP. Un colorant pouvait être remplacé. Un médicament ne le pouvait pas. La distinction établie par Lillie en 1969 est la même que celle qui détermine aujourd’hui ce que contient un flacon.