Metileno urdina eta mitokondrioak: elektroi-garraioa eta ebidentzia

Irudikatu bi prestakin elkarren ondoan. Biek dituzte rotenonaz pozoitutako garuneko mitokondrioak; rotenona arnas katearen I. konplexua blokeatzen duen substantzia kimikoa da. Bietako batean, esperimentatzaileak metileno urdinaren dosi mikromolar bat gehitzen du pipetaz. Oxigeno-kontsumoa partzialki berreskuratzen da. Mintzaren tentsioa partzialki itzultzen da. ATP sintesi apur bat berrabiarazten da. Ondoko kubetan, peroxido-sentsore batek istorioaren beste erdia kontatzen du: hidrogeno peroxidoaren ekoizpena hainbat aldiz biderkatu da, probatutako dosi guztietan eta erabilitako substratu guztiekin.

Bi neurketak zuzenak dira. Metileno urdina elektroi-garraiatzaile bat da, arnas katearen zati kaltetu bat saihestuz korronteari eutsi diezaiokeena; eta garraiatzaile horrek berak peroxidoaren ordainsaria kobratzen du hori egitean. Bi gertakariak aldi berean kontuan hartuz gero, metileno urdinak funtzio mitokondrialean duen eraginari buruzko literatura ulergarri bihurtzen da. Bakarra kontuan hartuz gero, miraria edo mehatxua dirudi, lehenengo zein artikulu ireki duzun.

Elektroi-garraioa, argi azalduta

Arnas katea errelebo-lerro bat da. Elektroiak I. konplexuan sartzen dira (NADHtik), edo II. konplexuan eta harekin lotutako flabina-entzimetan (sukzinatotik eta antzeko emaileetatik); III. konplexutik igarotzen dira c zitokromo garraiatzaile mugikorrera, eta gero IV. konplexutik oxigenora. Eskualdaketa bakoitzak protoiak ponpatzen ditu barne-mintzaren beste aldera, eta sortutako gradienteak ATP sintesia bultzatzen du. Geltoki bat blokeatuz gero, haren aurreko lerroa gelditu egiten da.

Metileno urdinak mezulari paralelo gisa txertatzen du bere burua. Haren forma oxidatuak aurreko garraiatzaileetatik elektroiak hartzen ditu, eta forma erreduzitu kolorge bihurtzen da, leukometileno urdina; horrek elektroi horiek katean aurrerago entregatzen ditu, eta urdin bihurtzen da berriro. Bi formak redox bikotearen azalpenean deskribatzen dira, eta errelebo-portaera zabalagoa mekanismo orokorraren azalpenean lantzen da. Argitu gabeko kontua da mezularia non sartzen den berriro lerroan: Qo gunea izenez ezagutzen den III. konplexuko kinola lotzeko poltsikoan, edo zuzenean c zitokromoan. Zein irteera nagusitzen den baldintzen araberakoa da, III. konplexua saihestearen analisiak xeheki azaltzen duen bezala.

Karraskarien hiru ikerketek benetan neurtu zutena

Hiru ikerketek garuneko mitokondrio isolatuak erabili zituzten, hau da, zelulatik ateratako eta konposizio zehaztuko disoluzio indargetzaile batean esekitako organuluak. Ez zen zelula osorik, dosia jasotako animaliarik edo giza parte-hartzailerik egon. Kontzentrazioak organuluen inguruko bainuari dagozkio, ez gizaki baten ahozko dosiari. Esparru hori argi mantenduz gero, zenbakiek argi hitz egiten dute.

Lehen ikerketak, 100 nanomolarretik 2 mikromolarrera arteko kontzentrazioetan erabilitako akurien garuneko mitokondrio isolatuetan, onura eta kostua prestakin berean aztertu zituen. Mitokondrio osasuntsuetan, koloratzaileak atsedeneko oxigeno-kontsumoa handitu zuen, baina ADPk estimulatutako arnasketa ez zuen aldatu; beraz, akoplatutako ATP ekoizpena ez zen hobetu. I. konplexua blokeatuta zegoenean, 2 mikromolarrek ATP sintesia minutuko eta miligramoko 46 nanomoletik 93ra berreskuratu zuten, ohiko tasa 1109 ingurukoa izanik. III. konplexua blokeatuta zegoenean, dosi berak ATP ekoizpena 46 ingurutik 63ra berreskuratu zuen, ohiko tasa 910 ingurukoa izanik. Tentsioa eta kaltzioaren xurgapena partzialki berreskuratu ziren. Ezin izan zen zianuroak eragindako IV. konplexuaren blokeoa saihestu; horrek elektroi-irteera erabilgarria funtzionatzen duen IV. konplexuaren aurretik kokatzen du. Berreskuratze guztiak estatistikoki errealak eta txikiak izan ziren: ohiko ATP ekoizpenaren zifra bakarreko ehunekoak.

Bigarren ikerketak, 1 mikromolar inguruko kontzentrazioan erabilitako saguen garun-kortexeko mitokondrioetan, I. konplexua saihestu zitekeela baieztatu zuen, eta muga III. konplexuan ezarri zuen. Rotenonak arnasketa minutuko eta miligramoko 121 nanomol oxigeno ingurutik 2 baino gutxiagora jaitsi zuen, eta koloratzaileak 21 ingurura igo zuen, ohikoaren seiren batera gutxi gorabehera; mintzaren tentsioa, berriz, ia erabat berreskuratu zen. Baina III. konplexua blokeatu ondoren, ez arnasketa ez tentsioa ez ziren berreskuratu 1 eta 5 mikromolar arteko kontzentrazioetan, eta blokeoak koloratzaileak eragindako peroxido-seinalea ezabatu zuen. Egileek proposatu zuten koloratzaile erreduzituak III. konplexuko Qo gunean entregatzen dituela elektroiak: gune hori okupatuta badago, mezulariak ez du non entregatu.

Hirugarren ikerketak, nagusiki 2 mikromolarreko kontzentrazioan erabilitako sagu, arratoi eta akurien garuneko mitokondrioetan, desadostasuna zuzenean probatu zuen, eta III. konplexuaren blokeoa saihestu daitekeela ikusi zuen. Qo gunearen inhibitzaileak, mixotiazolak, oinarrizko arnasketa ehuneko 88 murriztu zuenean, koloratzaileak oxigeno-kontsumoa blokeatu gabeko tasaren ehuneko 62 ingurura berreskuratu zuen. Zuzeneko proba batean, mikromolar erdiko kontzentrazioak c zitokromo exogenoa erreduzitu zuen, baita III. konplexua blokeatuta zegoenean ere; horrek NADHtik koloratzailean zehar c zitokromora eta handik IV. konplexura doan bidea babesten du. Baina berreskuratutako arnasketak portaera anormala izan zuen: gehitutako ADPk oxigeno-kontsumoa jaitsi zuen, igo beharrean, eta ATP sintesia blokeatzeak arnasketa estimulatu zuen. Tentsioa partzialki baino ez zen birpolarizatu. Oxigeno-kontsumo handia akoplamendu alderantzikatuarekin ez da energia-ekoizpen normala.

Zergatik ez datozen bat laborategiak, eta zerk argitzen duen kontua

Espezieetan oinarritutako azalpenak huts egiten du lehenik. Hirugarren taldeak lana hiru karraskari-espezietan errepikatu zuen, eta denetan saiheste-bide kualitatibo bera lortu zuen, baita saiheste-biderik ez zegoela jakinarazi zen sagu-anduian ere. Aldatzen direnak, ordea, kontzentrazioa (1 eta 2 mikromolar), inhibitzaileen dosiak, disoluzio indargetzaileak, isolamendu-metodoak eta, batez ere, alderatutako egoera energetikoa dira: saiheste-bidea argien ikusten da ADP gehitu aurretik, hain zuzen ere ADPren erantzun paradoxikoa agertzen denean. Diagrama zintzoak, beraz, baldintzen araberako bi irteera erakusten ditu: bat Qo gunean eta bestea c zitokromoan. Mezulariak tokiko kimikak uzten dion lekuan entregatzen du.

Peroxidoaren ordainsaria

Kostuaren aldeko emaitzak berreskuratzearen aldekoak bezain koherenteak dira. Akuriekin egindako lanean, koloratzaileak peroxido-askapena handitu zuen probatutako baldintza guztietan —atsedenean, ATP sintetizatzean eta kimikoki kaltetuta—, hiru substratuekin. ATP sintesian, ekoizpena minutuko eta miligramoko 148 pikomol ingurutik 1500 baino gehiagora igo zen 1 mikromolarreko kontzentrazioan, eta 100 nanomolarrek ere seinalea lau aldiz baino gehiago handitu zuten. Koloratzaileak peroxidoaren ezabapena ere gutxi gorabehera 2.6 aldiz moteldu zuen; beraz, seinaleak eraketa azkarragoa eta ezabapen motelagoa islatzen ditu. Proposatutako kimika koloratzaile erreduzituak oxigenoa zuzenean erreduzitzea da, superoxido detektagarririk gabe; hala ere, hori interpretazio bat da oraindik, ez frogatutako urrats bat.

Saguekin egindako lanak ikuspegia modu erabilgarrian konplexuago bihurtzen du. Peroxidoa nabarmen igo zen dosiarekin: minutuko eta miligramoko 76 pikomol inguruko oinarrizko mailatik ia 2000ra, 2 mikromolarreko kontzentrazioan. Hala ere, III. konplexuaren blokeoak koloratzaileak eragindako osagaia ezabatu zuen. Peroxidoa koloratzaile erreduzituak oxigenoarekin erreakzionatzetik soilik etorriko balitz, katea blokeatzeak ez luke horrenbesteko eraginik izan behar. Badu, ordea; beraz, kateak parte hartzen du. Antioxidatzaileei eta prooxidatzaileei buruzko berrikuspenak bikoiztasun hori testuinguru zabalagoan kokatzen du, eta oxigenoaren eta ATPren arteko analisiak azaltzen du zergatik oxigenoaren zenbakiek bakarrik ez duten inoiz energiari buruzko baieztapen bat argitzen.

Berreskuratzea ez da konpontzea

Baztertu beharreko esaldia da «metileno urdinak mitokondrioak konpontzen al ditu». Konpontzeak zuzenketa iraunkorra esan nahiko luke: konplexuak berreraikitzea, farmakoa desagertu ondoren ere irauten duen akoplamendua, zelula osoetan berreskuratzea eta, ondoren, organismo bizidun baten funtzioa hobetzea. Hiru artikuluetako batek ere ez du hori erakusten. Erakusten dutena berehalako birbideratzea da, isolatu berriko organuluetan, blokeatze kimiko artifizialaren pean; ATP ekoizpena ohikoaren zati txikia da, eta akoplamendua batzuetan benetan bitxia. Rotenona eta antimizina laborategiko tresnak dira, ez zahartzearen edo gizakien gaixotasun mitokondrialen ereduak, eta hemengo ezerk ez du esan nahi pertsona osasuntsu batek energia gehiago izango duenik. Hori ebidentziari buruzko beste galdera bat da, gizakietan egindako bere ikerketak dituena.

Hiru mugak mantentzen dute zintzo biohackingari buruzko edozein ondorio. Lehenik, bainuko kontzentrazioa ez da dosia: organulu isolatuen inguruan 0.1 eta 2 mikromolar arteko kontzentrazioa izateak ez du ezer esaten gizaki baten garuneko mitokondrio batean kontzentrazio libre hori zein ahozko kantitatek sortzen duen, bereziki koloratzailea mintzaren tentsioaren beraren arabera metatzen edo askatzen delako. Bigarrenik, oxigenoa ez da energia: koloratzaileak oxigeno-kontsumoa handitu dezake zikloen eta ihesen bidez, baita fosforilazio produktiboaren bidez ere; beraz, ATPren eta tentsioaren neurketarik gabeko errespirometriak ezin du energiari buruzko baieztapen bat justifikatu. Hirugarrenik, onura eta zama esaldi berean eman behar dira: tentsioa edo ATP berreskuratu dela dioen edozein adierazpenek aldi bereko peroxido-igoera aipatzen ez badu, esperimentua oker azaltzen du. Lotutako ñabardurak dira NADen redox oreka, dosi-erantzunaren forma eta saiakuntzen gida.

Ohar praktiko bat: elektroi-garraioa molekula zehatz horren propietatea da. Azure B bezalako ahaide desmetilatuak ere redox-aktiboak dira, baina portaera desberdina dute; beraz, partzialki degradatutako disoluzio batekin egindako esperimentua ez da koloratzaile osoarekin egindakoaren berdina. Hori da farmakopeiako espezifikazio osoa eta argitaratutako lote-dokumentua eskatzeko arrazoi bat, metalak soilik aztertzen dituen proba baten ordez. Argiak eragindako kimikak beste zuhurtzia-ohar bat gehitzen du argiztatutako erabileretarako; argi gorriarekin egindako konbinazioen atalean lantzen da.

Baieztapen mugatuak horri guztiari eusten dio, eta merezi du gordetzea: metileno urdinak baldintzapeko elektroi-mezulari gisa jardun dezake mitokondrio isolatu kaltetuetan, fluxua partzialki mantenduz, peroxidoaren kostuarekin. Hortik haragoko guztia —energia, bizi-luzetasuna, konpontzea— ikerketa hauek inoiz emateko diseinatu ez ziren ebidentziaren zain dago.