La historia del azul de metileno: del colorante a la medicina y la investigación

El azul de metileno llegó a un paciente antes de llegar a una farmacia.

El informe de 1891 de Paul Guttmann y Paul Ehrlich sobre el uso del colorante en la malaria contiene dos gráficas de temperatura. La segunda abarca del 13 de julio al 5 de agosto, con el tratamiento anotado día a día en el margen. Las entradas del 18 y 19 de julio dicen "1 × 0,05 Methylenblau". Los días siguientes registran cinco y siete dosis de la misma cantidad, y para el 22 de julio se había añadido al registro una pequeña cantidad de quinina. La línea de fiebre, que oscila entre 37 °C y 39.5 °C durante la primera mitad de la gráfica, se aplana tras la aparición del colorante y permanece entre aproximadamente 36 °C y 37.5 °C durante las tres semanas restantes.

El paciente era uno de dos, descritos en el artículo como un sirviente doméstico y un marinero. El compuesto que recibieron llevaba quince años siendo un colorante textil comercial, y ambos hombres se encuentran entre las primeras personas de las que existe constancia de haber sido tratadas con un fármaco completamente sintético dirigido contra un organismo específico.

El colorante fue primero

El primer colorante sintético con éxito comercial fue creado por William Henry Perkin en 1856. Perkin tenía dieciocho años, trabajaba en un laboratorio doméstico durante las vacaciones de Pascua e intentaba sintetizar quinina. En su lugar obtuvo un residuo negro, lo disolvió y encontró un color que se fijaba de forma brillante a la seda. Lo patentó en agosto de 1856 y, a finales de 1857, ya tenía una fábrica que abastecía a una tintorería de seda de Londres.

En 1875 Adolf von Baeyer sintetizó un colorante rojo y lo llamó eosina, por Eos, la palabra griega para el amanecer. En 1876 Heinrich Caro, entonces director del laboratorio de Badische Anilin- und Soda-Fabrik, desarrolló el azul de metileno junto con Baeyer como un colorante a base de anilina para algodón. Su estructura química no quedó establecida hasta unos nueve años después.

Ese origen sigue siendo visible en la forma en que se denomina la sustancia. "Azul de metileno" es un nombre comercial procedente del catálogo de colorantes, no una descripción química. El compuesto al que se refiere es cloruro de metiltioninio, y las diferencias entre el nombre, la sal y sus hidratos importan en cuanto alguien pesa el material o lee una especificación.

La tinción fue el puente

La ruta desde las fábricas de colorantes hasta el hospital pasó por el microscopio y comenzó antes de que existiera el azul de metileno. Wilhelm Erb fue la primera persona en aplicar un colorante sintético a la sangre, utilizando ácido pícrico en 1865, y observó un patrón reticular dentro de algunos glóbulos rojos.

La tesis doctoral de Paul Ehrlich de 1878 comparó la tinción histológica con el teñido de textiles y sostuvo que ambos eran reacciones químicas. Mientras trabajaba con Robert Koch en el bacilo de la tuberculosis, clasificó los colorantes de anilina en clases ácidas y básicas y estableció que cada clase coloreaba partes distintas de una célula. En 1880 mezcló ambas: una solución saturada de azul de metileno vertida en fucsina ácida hasta que el sobrenadante se aclaraba. El resultado, al que llamó neutralen Farbkörper o tinción neutra, producía tres colores en lugar de uno, revelaba gránulos en las células polimorfonucleares que antes no habían sido visibles y permitió realizar el primer recuento diferencial de leucocitos. Como esos gránulos absorbían ambos componentes de la mezcla, Ehrlich acuñó la palabra neutrófilo para las células que los contenían.

Dos años después, Koch utilizó azul de metileno para encontrar el bacilo de la tuberculosis, y en 1883 Ehrlich mejoró el método. En 1886 publicó una observación de otro tipo: inyectó el colorante en animales vivos y comparó la intensidad con la que cada órgano lo absorbía, y concluyó que tenía una marcada afinidad por el tejido cerebral y nervioso. Atribuyó esa afinidad al ciclo de oxidación-reducción del colorante, que había observado el año anterior. Ese ciclo también explica por qué una solución de azul de metileno pierde su color cuando se consume su oxígeno y lo recupera cuando vuelve a entrar aire. Los experimentos que midieron por primera vez las consecuencias de ese ciclo pertenecen a una década posterior, y el mecanismo en sí es un tema distinto de la historia.

El parásito y el núcleo púrpura

Alphonse Laveran descubrió el parásito de la malaria en 1880 examinando sangre fresca sin teñir. Para verlo de forma rutinaria en un frotis seco hacía falta una tinción, y las tinciones de la época solo producían rojo y azul.

En 1888, el patólogo polaco Czesław Cheçinski sustituyó la fucsina ácida por eosina, creando una mezcla de azul de metileno y eosina. El caso que dio origen a su método fue el de un soldado que había muerto de malaria el 30 de septiembre de 1887. En las extensiones de sangre, Cheçinski observó formas azules parecidas a margaritas, actualmente reconocidas como Plasmodium malariae, y formas falciformes, actualmente reconocidas como los gametocitos de Plasmodium falciparum. El resultado puso fin de una vez a dos explicaciones rivales de la enfermedad: la teoría del miasma y la afirmación de Edwin Klebs y Corrado Tommasi-Crudeli de que la malaria era causada por una bacteria.

El parásito era visible. Su núcleo no lo era, lo que dejaba abierta la cuestión de su naturaleza. Ernst Malachowski, médico en Breslau, resolvió ese problema primero por accidente y luego deliberadamente. En 1889 observó una tinción diferencial del núcleo plasmodial en una preparación y no pudo reproducirla. Acidificar el azul de metileno no ayudó. Alcalinizarlo con bórax producía el efecto cada vez. Demostró públicamente la técnica el 15 de junio de 1890 y la publicó ese mismo año, con un método más completo en agosto de 1891.

Dmitri Romanowsky publicó su propia versión en septiembre de 1891. Sus mejores resultados procedían de una botella olvidada y mohosa de solución de azul de metileno con más de dos meses de antigüedad. El procedimiento de Malachowski era deliberado y, según sus propias palabras, fácilmente reproducible; el de Romanowsky fue un callejón sin salida que funcionó una vez. Aun así, el epónimo recayó en Romanowsky, y la disputa sobre quién produjo el púrpura que hizo visible el núcleo es otra historia, con sus propios documentos.

Figura: la segunda gráfica de temperatura del informe de Guttmann y Ehrlich de 1891. El panel superior abarca del 13 al 24 de julio y el inferior del 25 de julio al 5 de agosto; las anotaciones del margen indican las dosis administradas, y la temperatura permanece cerca de lo normal durante las tres últimas semanas del registro. Reproducida del informe escaneado para Krafts, Hempelmann y Skórska-Stania, Parasitology Research* 111:1–6 (2012), PMID 22411634.

La maduración resultó ser desmetilación

Nadie implicado en la década de 1890 sabía qué hacía la "maduración" al azul de metileno. La respuesta surgió de la química industrial. Heinrich August Bernthsen había sintetizado el compuesto precursor fenotiazina en 1883, estableció en 1885 que el azul de metileno pertenecía a esa familia y demostró durante el mismo periodo que las condiciones alcalinas eliminan grupos metilo del colorante, produciendo los compuestos que hoy se conocen como azures.

Bernard Nocht extrajo la fracción activa en 1898 y 1899 y solo pudo llamarla Rot aus Methylenblau, rojo procedente del azul de metileno. Michaelis la identificó como azure I en 1901. Jenner introdujo metanol absoluto como disolvente para el precipitado del colorante en 1899, lo que eliminó la necesidad de fijar con calor las extensiones de sangre; Leishman y Reuter combinaron ambos avances; Wright publicó un método simplificado en 1902. La aportación de Giemsa, también en 1902, consistió en dejar de depender de una solución madurada al azar y utilizar en su lugar cantidades medidas de colorantes conocidos. Después se negó a publicar cómo fabricaba azure de metileno puro y vendió el método al laboratorio del Dr. Grübler, que comercializó el producto como azure I y afirmó que solo su versión era una auténtica tinción de Giemsa.

Dos guerras mundiales terminaron el trabajo por accidente. Cuando los colorantes alemanes dejaron de estar disponibles, Lillie, Roe y Wilcox trabajaron con los sustitutos estadounidenses y descubrieron que la mejor tinción procedía de tres componentes separados: azul de metileno puro, su producto de degradación Azure B y eosina. Esos tres siguen siendo los principales componentes de la tinción utilizada para diagnosticar la malaria en la actualidad, bajo un nombre que ahora reúne a Malachowski, Wright y Giemsa.

Figura: formas anulares de Plasmodium falciparum* en glóbulos rojos humanos, teñidas con un método de tipo Romanowsky. La estructura púrpura dentro del anillo es la cromatina que el azul de metileno tratado con bórax de Malachowski hizo visible por primera vez. Imagen de Ernst Hempelmann, publicada en el dominio público.

Un nombre, varios materiales

Los años que separaron esos componentes dejaron un problema que sobrevivió a la propia química. Ralph Lillie trazó en 1969 la distinción entre las tinciones biológicas, "fabricadas según especificaciones estrictas acordes con sus usos delicados y exigentes", y las tinciones no biológicas para colorear textiles, que "requieren estándares de fabricación menos rigurosos y exigentes". Ambos tipos de producto llevaban el mismo nombre, y la diferencia entre ellos nunca fue una simple diferencia de grado. Una especificación redactada para algodón y otra redactada para un reactivo diagnóstico no son intercambiables, y un material fabricado según la especificación textil no estaba destinado a ser ingerido.

Azure B es el ejemplo más claro. Es la forma monodesmetilada del azul de metileno, posee una actividad farmacológica medible propia y estuvo presente como componente no controlado de las preparaciones clínicas de azul de metileno durante más de un siglo antes de que alguien separara ambos compuestos. Un grupo descubrió que el tejido humano obtenido en autopsias tras la administración de azul de metileno contenía entre 5 y 14 por ciento de azul de metileno sin modificar y entre 86 y 95 por ciento de Azure B. Si una preparación determinada debe contener Azure B, y en qué límite, es una cuestión de especificación, y la investigación sobre Azure B como impureza y metabolito continúa a partir de ahí.

En la especificación también reside la consecuencia práctica. El cumplimiento de USP es la vía hacia la mayor pureza que ofrece el mercado, porque se trata de un estándar completo y publicado de ensayos, no de una única medición. Abarca identidad, valoración, impurezas orgánicas incluidos los colorantes azure, disolventes residuales, impurezas elementales, residuo de ignición, límites microbianos y endotoxinas bacterianas. Un certificado que informa de un resultado de metales pesados y lo denomina cumplimiento de USP ha informado de una sola línea de esa lista.

Blupreme obtiene su azul de metileno de un fabricante farmacéutico y publica el certificado de análisis completo, sometiendo a ensayo toda la especificación USP en lugar de limitarse a los metales pesados. La guía para leer un certificado de análisis y lo que la designación USP establece y no establece explican cómo comprobar el documento frente a la afirmación.

Lo que la historia permite afirmar y lo que no

El linaje es real y es más largo de lo que sugieren la mayoría de las páginas de producto. El azul de metileno se utilizó para tratar la malaria en 1891, se describió como sedante en la psicosis agitada en 1899, y su cadena lateral se extiende a través de la quinacrina, la cloroquina, la prometazina y la clorpromazina. El artículo de Ehrlich de 1890 con Arthur Leppmann describió alivio del dolor neurálgico y reumático, y después consideró y decidió no probar el colorante en enfermedades mentales.

Nada de eso establece un uso moderno. El resultado sobre malaria de 1891 consistía en dos pacientes y una gráfica de temperatura. La familiaridad prolongada con una molécula es una razón para estudiarla, no un resultado. La historia del compuesto como fármaco y los ensayos modernos sobre malaria responden a preguntas distintas de las que Ehrlich planteaba, y los criterios de valoración deben interpretarse en sus propios términos.

Hay un detalle en el registro que pertenece al presente más que al pasado. Cuando los investigadores realizaron ensayos de azul de metileno contra la malaria en Burkina Faso durante la década de 2000, se encontraron compitiendo por material de grado farmacéutico e informaron de que el precio de la materia prima había aumentado aproximadamente por un factor de cien una vez que contaba con validación GMP. Un colorante podía sustituirse. Un fármaco no. La distinción que Lillie trazó en 1969 es la misma que determina lo que contiene una botella hoy.