¿Cómo funciona el azul de metileno? Química redox y mecanismos

Un matraz con tapón sobre una mesa de laboratorio es la introducción honesta más breve a cómo funciona el azul de metileno. Agua, glucosa, una pizca de hidróxido de sodio y suficiente colorante para volver el líquido de un azul intenso e inconfundible. Espere unos minutos y el azul desaparece hasta que el matraz parece contener solo agua. Agítelo y el color reaparece de inmediato. Después vuelve a desvanecerse, y seguirá haciéndolo mientras haya glucosa dispuesta a ceder electrones y oxígeno dispuesto a aceptarlos.

Nada en el colorante ha cambiado salvo el número de electrones que transporta. Oxidado, es azul. Reducido, no lo es. Casi todo lo demás que aparece en la literatura terapéutica y de investigación sobre esta molécula se deriva de ese único paso reversible, porque una molécula capaz de tomar electrones de un socio y entregárselos a otro es un relé, y un relé no hace nada por sí solo. Lo que hace depende por completo de qué haya en cada uno de sus extremos.

Dos formas y por qué importa el par

La forma oxidada es un sistema de anillos plano y con carga positiva. Esa forma plana y cargada explica por qué se apila contra los ácidos nucleicos, por qué se une a estructuras sialiladas de las membranas celulares y por qué absorbe con intensidad la luz visible entre aproximadamente 600 y 700 nanometres, que corresponde a la parte del espectro que el ojo humano percibe como azul.

La forma reducida es distinta. No tiene carga, se disuelve en grasa en lugar de agua y es incolora. Su ionización es muy baja al pH del interior del cuerpo, del orden de unos pocos per cent. Por eso, la molécula reducida atraviesa fácilmente una membrana celular por difusión y, una vez dentro, donde el entorno es más oxidante, puede volver a oxidarse y quedar efectivamente atrapada. El sistema de anillos oxidado es plano; el reducido puede retorcerse. Esas consecuencias estructurales, y el propio cambio de color, forman parte de la historia de ambas formas por derecho propio y se explican con más detalle en la comparación entre el azul de metileno y el azul de leucometileno.

Aceptar electrones

El colorante oxidado acepta electrones de una amplia variedad de donantes. La glucosa del matraz de demostración es uno de ellos. Dentro de una célula, los nucleótidos de piridina reducidos y los componentes de la cadena mitocondrial de transporte de electrones son otros. Cuando el azul de metileno se reduce en un tejido que contiene oxígeno, el ciclo que establece consume tanto el agente reductor como el oxígeno y produce especies reactivas de oxígeno, principalmente peróxido de hidrógeno. El colorante sale del ciclo sin cambios, listo para repetirlo.

Este último punto explica una contradicción que, de otro modo, parecería descuidada. En la literatura, el azul de metileno se describe tanto como prooxidante como antioxidante, y ambas descripciones son defendibles. Puede reducir la producción de superóxido al actuar como aceptor artificial de electrones, desviando el flujo de electrones de los sitios enzimáticos donde, de otro modo, el oxígeno se convertiría en radicales superóxido. En cultivos de células hepáticas se ha demostrado que induce enzimas de defensa antioxidante de fase 2, entre ellas la tiorredoxina reductasa 1 y la NADPH quinona oxidorreductasa. Cuál de las dos facetas se observa depende de qué extremo del relé tenga escasez de electrones en ese momento. Una pregunta como «¿es el azul de metileno un antioxidante?» no está bien formulada hasta que se especifica en qué sistema, a qué concentración y con qué otras sustancias presentes.

Transferir los electrones

Una vez que el colorante contiene un electrón adicional, pueden ocurrir tres cosas bastante distintas, que suelen describirse bajo un mismo encabezado. No deberían agruparse así.

Puede transferir el electrón a un centro metálico. El caso más claro es la hemoglobina que ha sido oxidada del estado ferroso al férrico. En ese estado no puede transportar oxígeno. En los glóbulos rojos, una enzima reduce el colorante y el colorante reducido transfiere después electrones al hierro oxidado del hemo de forma no enzimática, restaurando la hemoglobina funcional y devolviendo el colorante a su forma oxidada. El colorante no se consume durante este proceso; entra en un ciclo. El contexto clínico que se basa en esta reacción pertenece al ámbito hospitalario, y la explicación del azul de metileno en la metahemoglobinemia describe cómo se utiliza y por qué se supervisa tan estrechamente.

Una nota necesaria sobre las fuentes: las dos revisiones en las que se basa este artículo no identifican el mismo cofactor reductor para el paso enzimático; una indica NADH y la otra NADPH. La discrepancia es real y no está resuelta en las fuentes disponibles aquí, por lo que la descripción más segura consiste en explicar la función de cada parte en lugar de atribuirla a un único cofactor.

Puede transferir energía, o un electrón, al oxígeno si hay luz. Esta vía solo existe bajo iluminación. El colorante excitado alcanza un estado triplete y, desde ahí, son posibles dos mecanismos. En el primero, el colorante excitado interactúa directamente con una molécula vecina, tomando un hidrógeno o transfiriendo un electrón, lo que genera radicales; reaccionar de este modo con el agua produce radicales hidroxilo. En el segundo, la energía de excitación se transfiere al propio oxígeno y produce oxígeno singlete, una especie altamente electrofílica que se desintegra en microseconds y que se acepta de forma general como la principal vía por la que el azul de metileno iluminado daña las células microbianas. Entre los efectos documentados se encuentran las reacciones con los lípidos y péptidos de la envoltura celular y con las bases de guanina del ADN.

La consecuencia práctica de esta vía es que la iluminación cambia las cifras en varios órdenes de magnitud. En los datos recopilados por Wainwright y Crossley, el azul de metileno frente a Pseudomonas aeruginosa presenta una concentración bactericida mínima de alrededor de 500 micromolar en la oscuridad y de alrededor de 25 micromolar con una dosis de luz de 12 joules per square centimetre. Frente a una cepa de Staphylococcus aureus, los valores en oscuridad y bajo iluminación son ambos de 5 micromolar. En otras palabras, que la molécula pueda considerarse antimicrobiana no es una propiedad exclusiva de la molécula; es una propiedad de la molécula junto con la luz.

Puede actuar directamente sobre un sitio enzimático, sin utilizar el relé. El azul de metileno oxida el hierro ferroso unido a la óxido nítrico sintasa, lo que inactiva la enzima. Bloquea la guanilato ciclasa soluble, y entre 1 y 10 micromolar es la concentración habitual de laboratorio utilizada para ese fin. Inhibe la monoamino oxidasa tipo A con un IC50 de entre 27 y 180 nanomolar, que es el mecanismo detrás de la interacción bien documentada con los inhibidores de la recaptación de serotonina y la razón por la que las interacciones farmacológicas del azul de metileno constituyen una categoría propia.

Estas tres vías son químicamente distintas. Reducirlas a una única afirmación de que el azul de metileno funciona mediante ciclos redox es la principal razón por la que tantos textos sobre él parecen a la vez seguros de sí mismos y vagos.

Cuatro distinciones que determinan si una afirmación mecanística significa algo

Qué forma. El colorante reducido no es intercambiable con el colorante oxidado. La inhibición de la acetilcolinesterasa ilustra la trampa: durante una incubación in vitro prolongada, el azul de metileno se reduce progresivamente a su forma incolora y la inhibición disminuye, porque la molécula reducida no inhibe esa enzima. Un ensayo que dure lo suficiente como para cambiar la forma registrará un efecto más débil e invitará a una explicación incorrecta.

Qué concentración. El intervalo de laboratorio para la inhibición de la guanilato ciclasa soluble es de 1 a 10 micromolar. Eliminar la transmisión mediada por glutamato en cortes de hipocampo de rata requirió de 5 a 50 micromolar. Se han descrito efectos tóxicos en cultivos celulares por encima de 100 micromolar. No son el mismo experimento, y un mecanismo confirmado a 50 micromolar no está automáticamente disponible para un paciente cuya concentración plasmática sea solo una fracción de ese valor.

Qué vía. La biodisponibilidad oral absoluta es de alrededor de 72 per cent, y la semivida plasmática terminal es de 5 to 7 hours. La administración oral produce concentraciones más altas en el intestino y el hígado; la administración intravenosa produce concentraciones más altas en el cerebro. La vía determina qué tejido entra en contacto con los electrones.

Qué modelo y si las luces estaban encendidas. Gran parte de la literatura mecanística procede de cultivos celulares y estudios con roedores, y los resultados in vitro con esta molécula dependen de la exposición a la luz, del potencial de membrana y del estado redox de las células, porque una lámpara de microscopio basta para fotosensibilizarla. Entre 65 and 85 per cent de una dosis administrada se reduce a la forma incolora en los glóbulos rojos y el tejido periférico. Cada una de estas variables se interpone entre un mecanismo limpio observado en una placa y una afirmación sobre una persona.

Por qué la cuestión de la pureza es una cuestión química

La iluminación desmetila el azul de metileno. El primer producto es Azure B, después Azure A y luego tionina, y una mayor intensidad de luz produce más degradación que una menor. Por tanto, una molécula cuya utilidad depende de su capacidad para aceptar y donar electrones es también una molécula cuyos productos probables de degradación son parientes químicos cercanos que permanecen en la misma solución. La composición de lo que hay en el recipiente no es un detalle cosmético.

Por eso, la conformidad con la especificación USP es la prueba relevante para un comprador. Un producto que no la cumple es un colorante, y un colorante contiene impurezas, entre ellas Azure B, metales pesados y disolventes residuales, que una persona que lo ingiere no quiere consumir. Otra trampa es el vendedor que analiza únicamente los metales pesados y presenta el resultado como si demostrara un cumplimiento total. Blupreme se ha asociado con un fabricante farmacéutico de azul de metileno y analiza la especificación completa: identidad, pureza, impurezas orgánicas, disolventes residuales, impurezas elementales, residuo de ignición, límites microbianos y endotoxinas bacterianas. Se publica el documento de análisis de laboratorio correspondiente a cada lote, y elegir un proveedor consiste en gran medida en comprobar si ese documento existe y qué abarca.

Un único par reversible. Varias vías que parten de él. La vía determina qué puede sostener una afirmación. :::