Glas methylen a mitocondria: cludiant electronau a'r dystiolaeth

Dychmygwch ddau baratoad ochr yn ochr. Mae'r ddau'n cynnwys mitocondria o'r ymennydd sydd wedi'u gwenwyno â rotenon, cemegyn sy'n rhwystro Cymhlyg I y gadwyn resbiradol. I un ohonynt, mae'r arbrofwr yn pibedu dos micromolar o las methylen. Mae'r defnydd o ocsigen yn adfer yn rhannol. Mae foltedd y bilen yn dychwelyd yn rhannol. Mae ychydig o synthesis ATP yn ailddechrau. Yn y ciwvet cyfagos, mae synhwyrydd perocsid yn adrodd hanner arall y stori: mae cynhyrchiant hydrogen perocsid wedi cynyddu sawl gwaith, ar bob dos a brofwyd, gyda phob swbstrad a roddwyd ar brawf.

Mae'r ddau ddarlleniad yn gywir. Cludydd electronau yw glas methylen a all gadw cerrynt yn llifo o amgylch rhan o'r gadwyn resbiradol sydd wedi'i difrodi, ac mae'r un cludydd yn codi toll mewn perocsid wrth wneud hynny. Cadwch y ddwy ffaith mewn cof ar yr un pryd, ac mae'r llenyddiaeth am effaith glas methylen ar weithrediad mitocondria yn dod yn ddealladwy. Cadwch un yn unig mewn cof, ac mae'n darllen fel gwyrth neu fygythiad, yn dibynnu ar ba bapur a agorwyd gennych gyntaf.

Y cludydd, mewn geiriau plaen

Llinell gyfnewid yw'r gadwyn resbiradol. Mae electronau'n mynd i mewn yng Nghymhlyg I (o NADH) neu yng Nghymhlyg II ac ensymau flafin cysylltiedig (o swcsinad a rhoddwyr tebyg), yn mynd drwy Gymhlyg III at y cludydd symudol cytocrom c, ac yna drwy Gymhlyg IV at ocsigen. Mae pob trosglwyddiad yn pwmpio protonau ar draws y bilen fewnol, ac mae'r graddiant sy'n deillio o hynny'n gyrru synthesis ATP. Rhwystrwch unrhyw orsaf, ac mae'r llinell i fyny'r gadwyn yn tawelu.

Mae glas methylen yn ymuno fel negesydd cyfochrog. Mae ei ffurf ocsidiedig yn cymryd electronau o gludwyr i fyny'r gadwyn, gan droi'n ffurf rydwythiedig ddi-liw, glas lewcomethylen, sydd wedyn yn trosglwyddo'r electronau hynny ymlaen i lawr y gadwyn ac yn troi'n las eto. Disgrifir y ddwy ffurf yn yr esboniad o'r cwpl rhydocs, ac mae'r ymddygiad cyfnewid ehangach yn rhan o esboniad y mecanwaith cyffredinol. Y cwestiwn sydd heb ei ateb yw ble mae'r negesydd yn ailymuno â'r llinell: ym mhoced rwymo cwinol Cymhlyg III, a elwir yn safle Qo, neu'n uniongyrchol wrth gytocrom c. Mae pa allanfa sy'n dominyddu yn dibynnu ar yr amodau, fel y mae dadansoddiad o osgoi Cymhlyg III yn ei egluro'n fanwl.

Beth a fesurodd tair astudiaeth o gnofilod mewn gwirionedd

Defnyddiodd y tair astudiaeth fitocondria ynysig o'r ymennydd, sef organynnau wedi'u tynnu o'r gell a'u dal mewn daliant mewn byffer diffiniedig. Dim celloedd cyfan, dim anifeiliaid a oedd wedi cael dos, dim cyfranogwyr dynol. Mae'r crynodiadau'n cyfeirio at yr hylif o amgylch yr organynnau, nid at ddos drwy'r geg i berson. Cadwch y cyd-destun hwnnw'n gyson, ac mae'r rhifau'n siarad yn glir.

Mapiodd yr astudiaeth gyntaf, mewn mitocondria ynysig o ymennydd mochyn cwta ar 100 nanomolar i 2 micromolar, y budd a'r gost mewn un paratoad. Mewn mitocondria iach, cynyddodd y llifyn y defnydd o ocsigen wrth orffwys ond gadawodd resbiradaeth wedi'i hysgogi gan ADP heb ei newid, felly ni wellodd cynhyrchiant ATP wedi'i gyplu. Pan rwystrodd yr ymchwilwyr Gymhlyg I, adferodd 2 micromolar synthesis ATP o 46 i 93 nanomol y funud fesul miligram, o gymharu â chyfradd arferol o tua 1109. Pan rwystrodd yr ymchwilwyr Gymhlyg III, adferodd yr un dos ATP o tua 46 i 63, o gymharu â chyfradd arferol o tua 910. Adferodd y foltedd a'r cymeriant calsiwm yn rhannol. Ni ellid osgoi rhwystr cyanid ar Gymhlyg IV, sy'n gosod yr allanfa ddefnyddiol i electronau i fyny'r gadwyn o Gymhlyg IV gweithredol. Roedd pob adferiad yn real yn ystadegol ac yn fach: canrannau un digid o gynhyrchiant ATP arferol.

Cadarnhaodd yr ail astudiaeth, mewn mitocondria o gortecs llygod ar tua 1 micromolar, fod modd osgoi Cymhlyg I, a gosododd derfyn wrth Gymhlyg III. Gostyngodd rotenon resbiradaeth o tua 121 i lai na 2 nanomol o ocsigen y funud fesul miligram, a chododd y llifyn hynny i tua 21, sef tua un rhan o chwech o'r lefel arferol, tra bod foltedd y bilen wedi adfer bron yn llwyr. Ond ar ôl rhwystro Cymhlyg III, ni adferodd resbiradaeth na foltedd ar draws 1 i 5 micromolar, ac ataliodd y rhwystr y signal perocsid a yrrwyd gan y llifyn. Cynigiodd yr awduron fod y llifyn rhydwythiedig yn trosglwyddo ei electronau wrth safle Qo Cymhlyg III: pan fo'r safle hwnnw wedi'i feddiannu, nid oes gan y negesydd unman i drosglwyddo ei lwyth.

Profodd y drydedd astudiaeth, mewn mitocondria o ymennydd llygod, llygod mawr a moch cwta, ar 2 micromolar yn bennaf, yr anghytundeb yn uniongyrchol, a chanfod bod modd pontio rhwystr ar Gymhlyg III. Gyda mycsothiasol, atalydd safle Qo, yn lleihau resbiradaeth waelodol 88 y cant, adferodd y llifyn y defnydd o ocsigen i tua 62 y cant o'r gyfradd heb y rhwystr. Mewn prawf uniongyrchol, rhydwythodd hanner micromolar gytocrom c alldarddol hyd yn oed tra oedd Cymhlyg III wedi'i rwystro, gan gefnogi llwybr o NADH drwy'r llifyn at gytocrom c ac ymlaen at Gymhlyg IV. Ond roedd y resbiradaeth a adferwyd yn ymddwyn yn annormal: roedd ychwanegu ADP yn lleihau'r defnydd o ocsigen yn hytrach na'i gynyddu, ac roedd rhwystro synthesis ATP yn ysgogi resbiradaeth. Dim ond yn rhannol yr ailbolareiddiodd y foltedd. Nid yw defnydd uchel o ocsigen gyda chyplu gwrthdro yn gynhyrchiant egni arferol.

Pam mae'r labordai'n anghytuno, a beth sy'n datrys y mater

Yr esboniad sy'n seiliedig ar rywogaeth sy'n methu gyntaf. Ailadroddodd y trydydd grŵp y gwaith mewn tair rhywogaeth o gnofilod a chael yr un patrwm ansoddol o osgoi'r rhwystr ym mhob un ohonynt, gan gynnwys y llinach o lygod lle yr adroddwyd nad oedd modd ei osgoi. Yr hyn sy'n wahanol yn hytrach yw'r crynodiad (1 yn erbyn 2 micromolar), dosau'r atalyddion, y byfferau, y dulliau ynysu, ac yn anad dim y cyflwr egniol sy'n cael ei gymharu: mae osgoi'r rhwystr ar ei amlycaf cyn ychwanegu ADP, sef yn union lle mae'r ymateb paradocsaidd i ADP yn ymddangos. Felly mae diagram gonest yn dangos dwy allanfa sy'n dibynnu ar yr amodau, un wrth safle Qo ac un wrth gytocrom c. Mae'r negesydd yn trosglwyddo ei lwyth lle mae'r cemeg leol yn caniatáu iddo wneud hynny.

Y doll perocsid

Mae ochr y gost yr un mor gyson ag ochr yr adferiad. Yn y gwaith ar foch cwta, cynyddodd y llifyn ryddhau perocsid ym mhob cyflwr a brofwyd: wrth orffwys, wrth syntheseiddio ATP ac wrth gael ei amharu'n gemegol, ar draws y tri swbstrad. Yn ystod synthesis ATP, cododd y cynhyrchiant o tua 148 i dros 1500 picomol y funud fesul miligram ar 1 micromolar, ac roedd hyd yn oed 100 nanomolar wedi mwy na phedwarplygu'r signal. Arafodd y llifyn y broses o waredu perocsid hefyd, tua 2.6 gwaith, felly mae'r signal yn adlewyrchu ffurfiant cyflymach ynghyd â chlirio arafach. Y cemeg a gynigir yw rhydwytho ocsigen yn uniongyrchol gan lifyn rhydwythiedig heb uwchocsid canfyddadwy, er mai dehongliad yw hynny o hyd yn hytrach na cham wedi'i brofi.

Mae'r gwaith ar lygod yn cymhlethu'r darlun mewn ffordd ddefnyddiol. Cododd perocsid yn serth gyda'r dos, o waelodlin o tua 76 i bron 2000 picomol y funud fesul miligram ar 2 micromolar, ond ataliodd rhwystro Cymhlyg III yr elfen a yrrwyd gan y llifyn. Pe bai perocsid yn dod yn unig o lifyn rhydwythiedig yn adweithio ag ocsigen, ni ddylai rhwystro'r gadwyn fod mor bwysig. Mae'n bwysig, felly mae'r gadwyn yn cymryd rhan. Mae yr adolygiad o wrthocsidyddion a phro-ocsidyddion yn gosod y ddeuoliaeth hon mewn cyd-destun ehangach, ac mae y dadansoddiad o ocsigen yn erbyn ATP yn esbonio pam nad yw ffigurau ocsigen ar eu pen eu hunain byth yn setlo honiad am egni.

Nid atgyweirio yw adfer gweithrediad

Yr ymadrodd y mae angen rhoi'r gorau iddo yw "a yw glas methylen yn atgyweirio mitocondria". Byddai atgyweirio'n golygu cywiriad parhaol: cymhlygion wedi'u hailadeiladu, cyplu sy'n parhau ar ôl i'r cyffur adael, adferiad mewn celloedd cyfan, ac yna gweithrediad gwell mewn organeb fyw. Nid yw'r un o'r tri phapur yn dangos hynny. Maent yn dangos ailgyfeirio acíwt mewn organynnau sydd newydd gael eu hynysu yn ystod rhwystr cemegol artiffisial, gyda chynhyrchiant ATP yn ffracsiynau bach o'r lefel arferol ac weithiau gyplu sy'n hollol ryfedd. Offer labordy yw rotenon ac antimycin, nid modelau o heneiddio na chlefyd mitocondriaidd dynol, ac nid oes dim yma'n trosi'n fwy o egni i berson iach, sy'n gwestiwn tystiolaeth ar wahân gyda'i lenyddiaeth ddynol ei hun.

Mae tri therfyn yn cadw unrhyw gasgliad am fiohacio yn onest. Yn gyntaf, nid dos yw crynodiad mewn hylif: nid yw 0.1 i 2 micromolar o amgylch organynnau ynysig yn dweud dim am ba swm drwy'r geg sy'n cynhyrchu'r crynodiad rhydd hwnnw wrth fitocondrion mewn ymennydd dynol, yn enwedig gan fod y llifyn yn cronni neu'n cael ei ryddhau yn dibynnu ar foltedd y bilen ei hun. Yn ail, nid egni yw ocsigen: gall y llifyn gynyddu'r defnydd o ocsigen drwy gylchu a gollyngiad yn ogystal â thrwy ffosfforyleiddio cynhyrchiol, felly ni all resbirometreg heb ddarlleniadau ATP a foltedd gyfiawnhau honiad am egni. Yn drydydd, mae'r budd a'r baich yn perthyn yn yr un frawddeg: mae unrhyw ddatganiad am foltedd neu ATP wedi'i adfer sy'n hepgor y cynnydd cydamserol mewn perocsid yn camadrodd yr arbrawf. Mae amodau perthnasol eraill yn cynnwys cydbwysedd rhydocs NAD, siâp yr ymateb i ddos a chanllaw'r profion.

Un nodyn ymarferol: mae'r gallu i gludo electronau yn briodwedd y moleciwl penodol. Mae moleciwlau perthynol wedi'u dadfethyleiddio, megis Azure B, hefyd yn weithredol mewn adweithiau rhydocs, ond maent yn ymddwyn yn wahanol, felly mae hydoddiant sydd wedi diraddio'n rhannol yn arbrawf gwahanol i lifyn cyfan. Dyna un rheswm dros fynnu'r fanyleb ffarmacopoeia lawn a dogfen swp wedi'i chyhoeddi yn hytrach na sgrinio am fetelau yn unig. Mae cemeg a yrrir gan olau yn ychwanegu cafeat cyfochrog ar gyfer defnyddiau lle mae golau'n cael ei daflu ar y llifyn; trafodir hyn o dan gyfuniadau â golau coch.

Mae'r honiad cyfyng hwn yn sefyll er gwaethaf hyn oll, ac mae'n werth ei gadw: gall glas methylen weithredu fel negesydd electronau, yn dibynnu ar yr amodau, mewn mitocondria ynysig sydd wedi'u difrodi, gan gadw rhywfaint o'r llif ar gost perocsid. Mae popeth y tu hwnt i hynny, egni, hirhoedledd, atgyweirio, yn aros am dystiolaeth nad oedd yr astudiaethau hyn erioed wedi'u cynllunio i'w darparu.