Els experiments que van vincular el blau de metilè amb la respiració cel·lular

La sang humana desfibrinada, mantinguda a 37 °C durant tres hores, consumeix al voltant del dos per cent de l'oxigen que conté. Si s'hi afegeix una petita quantitat de blau de metilè abans de la incubació, la mateixa sang en consumeix al voltant del seixanta-cinc per cent. No havia canviat res en les cèl·lules. Només havia canviat la solució.

Aquesta xifra prové d'un article de 1928 de George Harrop i E. S. Guzman Barron, de Johns Hopkins, i és l'origen de l'afirmació, àmpliament repetida, que el blau de metilè millora la respiració cel·lular. L'afirmació no és falsa, però té un abast més limitat del que sembla.

Què mesura realment la xifra de la taula

La variable mesurada era la captació d'oxigen, determinada mitjançant l'anàlisi de gasos. Harrop i Barron van filtrar sang acabada d'extreure a través de cotó a 10 °C per eliminar-ne els glòbuls blancs, van saturar la mostra amb oxigen, la van dividir, van afegir colorant a una de les porcions i les van analitzar totes dues després de la incubació. Els recomptes de leucòcits rarament superaven aproximadament un miler per mil·límetre cúbic. El consum d'oxigen s'expressava com la proporció del contingut inicial d'oxigen de la mostra que havia desaparegut.

També van mesurar el diòxid de carboni, i aquí el mètode els va posar obstacles. La sang desfibrinada alliberava fins a dos mil·limols de diòxid de carboni per 100 mL durant la primera hora d'incubació per motius aliens a la reacció estudiada, de manera que els quocients respiratoris de la sang sencera no eren utilitzables. Només les cèl·lules rentades en solució de Locke donaven xifres interpretables, que se situaven entre 0.73 i 0.80 tant amb el colorant com sense.

Aquest detall no és anecdòtic. En aquests articles, «respiració» vol dir intercanvi de gasos en un recipient tancat. La diferència entre el consum d'oxigen i la producció d'energia útil s'examina per separat a què ens diu i què no ens diu el consum d'oxigen sobre l'ATP.

El colorant aportava més allà on les cèl·lules respiraven menys

Els eritròcits madurs de mamífers gairebé no tenen cap consum d'oxigen mesurable. Els eritròcits nucleats de les aus sí que en tenen. Harrop i Barron van experimentar amb tots dos, i el contrast és l'eix del seu argument.

En les mostres de mamífers, el colorant multiplicava el consum entre vint i cinquanta vegades. En la sang d'oca, les cèl·lules de la qual ja respiraven, la taxa no arribava mai a superar el doble. Com més alta era la respiració inicial, menys hi podia aportar el colorant.

El mateix gradient apareix dins d'una sola espècie. Una mostra humana d'un pacient amb policitèmia vera, que contenia cèl·lules immadures, consumia l'11.3 per cent del seu oxigen sense colorant, davant del 2.8 per cent de les cèl·lules rentades d'un donant sa. El colorant només elevava el consum fins al 63.4 per cent, una acceleració de sis vegades, mentre que les cèl·lules normals acceleraven gairebé trenta vegades. El colorant feia que les cèl·lules madures s'acostessin al comportament de les immadures, que és precisament el que els autors afirmaven que feia.

El cianur ho hauria d'haver aturat

Se sabia que el cianur aturava l'oxidació cel·lular. Tot i això, Harrop i Barron el van afegir juntament amb el colorant.

Els resultats de la sang bovina són representatius. Sense cap addició, el contingut d'oxigen baixava de 22.61 a 22.03 volums per cent al llarg de tres hores. Amb blau de metilè baixava fins a 12.84. Amb blau de metilè i cianur de potassi a una concentració d'una cincmil·lèsima molar, baixava fins a 12.74. L'efecte del colorant es mantenia pràcticament intacte.

Figura: un registre continu de microrespiració d'eritròcits humans. La fletxa indica l'addició de blau de metilè. Abans, la corba és gairebé plana; després, puja de manera sostinguda. Reproduït de Harrop i Barron, Journal of Experimental Medicine 48:207–223 (1928), PMID 19869478.

La seva conclusió era que el colorant actuava com a transportador d'oxigen, «aportant una substància que ha desaparegut dels eritròcits no nucleats dels mamífers adults». Dos anys més tard, Michaelis i Salomon, de l'Institut Rockefeller, van formular el desacord en uns termes que han perdurat. O bé l'efecte del colorant era «una propietat accidental del colorant», o bé el colorant era «un model d'alguna substància desconeguda dels organismes». Aquesta disjuntiva no s'ha resolt. El que sí que ha canviat és que ara es poden descriure les cèl·lules amb molta més precisió.

Un extracte de fetge feia el mateix

Michaelis i Salomon van demostrar que els extractes d'òrgans obtinguts amb aigua freda produeixen la mateixa estimulació. El fetge de rata tenia l'efecte més intens, seguit del ronyó, la melsa i el testicle. El cervell, el múscul i el sèrum sanguini tenien poc efecte o cap.

Després van provar l'extracte en presència de monòxid de carboni. La respiració induïda tant per l'extracte com pel colorant es mantenia inalterada en una barreja d'un 98 per cent de monòxid de carboni i un 2 per cent d'oxigen. La mateixa barreja de gasos inhibia la respiració del llevat i la dels eritròcits nucleats d'aus de corral aproximadament entre un 60 i un 80 per cent, d'acord amb la descripció de Warburg d'un ferment respiratori sensible al monòxid de carboni. Per tant, la substància tissular no identificada no era l'enzim de Warburg.

Pel camí es van descartar diverses possibles identitats. El glutatió reduït i la cisteïna només produïen el consum d'oxigen necessari per a la seva pròpia oxidació. El coenzim de Harden i Young es va descartar perquè el múscul, que és on n'hi ha més, mostrava gairebé l'efecte més baix. El citocrom de Keilin, que havia rebut aquest nom uns anys abans, topava amb la mateixa contradicció. La seva pròpia proposta, que la substància activa provenia del nucli cel·lular, la van qualificar de mera hipòtesi.

L'efecte depenia d'unes condicions

Les cèl·lules havien d'estar intactes. L'hemòlisi causada per aigua destil·lada o per congelacions repetides eliminava la resposta tant al colorant com a l'extracte, i l'hemòlisi parcial la reduïa proporcionalment.

També calia sucre. La glucosa, la fructosa i la sacarosa permetien la respiració induïda pel colorant; el mannitol, no. Sense sucre no hi havia cap respiració, i semblava que el colorant danyava les cèl·lules durant el procés, de manera que afegir-hi glucosa una o dues hores més tard no la restablia. Els autors van suggerir que el colorant oxidava un component estructural necessari per a la cèl·lula.

La il·luminació augmentava considerablement l'efecte del colorant, tot i que l'efecte també era clar a les fosques. Altres colorants reductibles es comportaven de manera diferent: el blau de toluilè igualava o superava el blau de metilè, mentre que el disulfonat d'indi gairebé no feia res. No es va observar cap relació clara entre el potencial d'oxidació-reducció d'un colorant i la magnitud del seu efecte, cosa que els autors van atribuir a la permeabilitat de la membrana i a la toxicitat.

L'efecte seguia la fermentació, no la respiració

L'estudi de Barron de 1930 va passar de les suspensions cel·lulars als talls de teixit d'òrgans normals de rata i de tumors trasplantats.

En els teixits sense glicòlisi aeròbica, el blau de metilè no feia res o reduïa lleugerament el consum d'oxigen: al ronyó, aproximadament un 14 per cent; al pàncrees, aproximadament un 14 per cent; al fetge, aproximadament un 5 per cent. En els teixits que fermenten en presència d'oxigen, augmentava el consum: a la melsa, aproximadament un 8 per cent; al cervell, aproximadament un 13 per cent. Els augments en tumors anaven d'aproximadament un 27 per cent en un carcinoma de mama humà a més d'un 80 per cent en un sarcoma de Rous de pollastre, aproximadament en proporció a la glicòlisi aeròbica de cada teixit.

Figura: cada punt és un tipus de teixit. L'eix horitzontal és la glicòlisi aeròbica; l'eix vertical és el canvi en el consum d'oxigen després d'afegir blau de metilè. Dades de Barron, Journal of Experimental Medicine 52:447–456 (1930), Taula 6, PMID 19869777.

L'experiment amb cianur va produir aleshores la imatge inversa. Quan es bloquejava amb cianur la respiració dels teixits que abans no responien i la fermentació es feia evident, el colorant tornava a augmentar el consum d'oxigen: al ronyó, aproximadament un 59 per cent; al fetge, aproximadament un 19 per cent; a la melsa, aproximadament un 286 per cent; al testicle, aproximadament un 200 per cent.

Barron va proposar que el colorant podia servir com a prova de la capacitat fermentativa d'una cèl·lula o d'un teixit, i va acabar amb una especulació: potser algun dia, després de generacions de cultiu tumoral en un medi amb colorant, el metabolisme d'un tumor esdevindria permanentment semblant al del teixit normal. Era una pregunta de recerca formulada el 1930. No és una afirmació terapèutica.

Què no podien haver mesurat els experiments

El 1928 i el 1930, «respiració» volia dir consum d'oxigen. El trifosfat d'adenosina es va descriure per primera vegada el 1929, i la demostració que els mitocondris aïllats esterifiquen fosfat mentre transfereixen electrons va arribar el 1949. Cap dels primers articles sobre el blau de metilè no podia haver mesurat la producció d'energia, i cap no afirmava haver-ho fet.

Les cèl·lules són el segon problema. Els eritròcits madurs de mamífers no contenen mitocondris. Durant l'estadi de reticulòcit eliminen els mitocondris i els ribosomes mitjançant autofàgia selectiva, motiu pel qual un glòbul vermell madur funciona gràcies a la glicòlisi i depèn de la via de les pentoses fosfat principalment per obtenir NADPH, no ATP. En els experiments de 1928 no hi havia cap cadena de transport d'electrons per reparar. Fos el que fos allò que consumia l'oxigen, estava fent una altra cosa.

Ara es coneix amb força detall què era aquesta altra cosa. El blau de metilè accepta electrons dels equivalents reductors cel·lulars i es converteix en blau de leucometilè, que l'oxigen molecular torna a oxidar, tancant el cicle. En els glòbuls vermells humans, la flavina-reductasa dependent de NADPH i altres disulfur-reductases relacionades duen a terme l'etapa de reducció. Un estudi de 1976 amb glucosa marcada va trobar que el colorant estimula la via de les hexoses monofosfat, que l'efecte a baixa concentració depenia de l'oxihemoglobina i que una concentració més alta, 0.1 mM, generava peròxid d'hidrogen. Un colorant reduït que entra en contacte amb oxigen produeix peròxid, no enllaços fosfat.

En els mitocondris, el panorama és més controvertit del que admeten els resums divulgatius. Una línia de recerca sosté que el colorant pren electrons de la regió del complex I i els lliura al citocrom c. Una altra va trobar que, en mitocondris de cervell de ratolí, no pot restablir la respiració després d'un bloqueig amb antimicina, i va situar l'acceptor d'electrons al lloc d'unió de l'ubiquinol del complex III. Una tercera va trobar que concentracions baixes augmentaven el consum d'oxigen en repòs sense alterar la respiració estimulada per ADP. La formulació més directa d'aquesta idea és que el consum d'oxigen induït pel blau de metilè no depèn en absolut de la fosforilació oxidativa: persistia quan la cadena respiratòria estava inhibida, i també en preparacions que no en tenien.

També hi ha mesures directes de la diferència entre aquestes dues magnituds. En mitocondris aïllats de fetge de rata, l'augment de les concentracions de colorant reduïa els quocients de control respiratori i provocava inflament, cosa que els autors van descriure com a desacoblament de la fosforilació oxidativa. En fetge de rata perfós, el blau de metilè augmentava el consum d'oxigen mentre la relació ATP/ADP disminuïa.

L'experiència clínica transmet el mateix missatge. La metahemoglobinèmia es tracta amb aproximadament entre un i dos mil·ligrams de blau de metilè per quilogram per via intravenosa, mitjançant una via de reducció dependent de NADPH, i les dosis més altes provoquen l'afecció que es vol tractar. La mateixa revisió assenyala que l'efecte com a antídot és màxim en eritròcits intactes i disminueix quan hi ha hemòlisi: és la troballa sobre l'hemòlisi de 1930 que reapareix setanta-tres anys més tard en un context hospitalari. Un compost els efectes útils i perjudicials del qual se situen a banda i banda d'un llindar de dosi no és un compost del qual s'hagi de deduir la dosi a partir d'una mesura del consum d'oxigen.

Per què el lot forma part de la discussió

Harrop i Barron van observar una cosa que val la pena rellegir. El blau de metilè mateix produeix una banda a l'espectroscopi entre les dues bandes característiques de la metahemoglobina, «cosa que pot causar fàcilment confusió en una inspecció superficial». El colorant pot imitar la substància que es busca.

El mateix problema té una vessant química. Una fenotiazina relacionada present com a component minoritari té el seu propi comportament redox, la seva pròpia permeabilitat i la seva pròpia toxicitat. Un cas documentat concreta què hi ha en joc: en un estudi sobre la iodació del blau de metilè, les mostres que contenien aproximadament entre un 7 i un 8 per cent d'Azure B produïen principalment Azure B iodat, de manera que la impuresa, i no el blau de metilè, dominava la reacció.

Qualsevol persona que utilitzi blau de metilè com a reactiu, en un laboratori, en una taula de treball de tinció o en un aquari, treballa amb un ingredient sense especificar si el lot no ha estat caracteritzat. Les substàncies relacionades, la identitat, les impureses elementals, els dissolvents residuals i el residu d'incineració formen part de l'experiment, no són simple documentació accessòria. Blupreme obté el seu blau de metilè d'un fabricant farmacèutic i publica un certificat d'anàlisi complet, que verifica tota l'especificació USP i no només els metalls pesants; la guia per llegir un certificat d'anàlisi i què acredita i què no acredita la designació de grau USP expliquen com comprovar si el document avala allò que s'afirma.

La xifra era correcta

Els experiments de 1928 i 1930 es van fer amb cura, i la seva observació central ha perdurat: un colorant reductible pot fer que una cèl·lula que gairebé no respira consumeixi oxigen a una taxa moltes vegades superior a la de repòs, sense passar per l'etapa que bloqueja el cianur.

L'error apareix més tard, quan es llegeix «respiració» amb el seu significat modern. Una mesura de l'intercanvi de gasos ens diu que els electrons han arribat a l'oxigen. No ens diu que cap d'aquests electrons s'hagi utilitzat per produir ATP, i en una cèl·lula sense mitocondris la distància entre aquestes dues afirmacions és tan gran com pot arribar a ser. El mapa més ampli del que fa el blau de metilè a les cèl·lules situa la mateixa distinció en un marc més ampli, i la història del compost, de colorant a medicament explica com un colorant tèxtil va arribar a aquests experiments.