Những thí nghiệm liên hệ xanh methylen với hô hấp tế bào

Máu người đã loại fibrin, được giữ ở 37 °C trong ba giờ, tiêu thụ khoảng hai phần trăm lượng oxy mà nó chứa. Thêm một lượng nhỏ xanh methylen trước khi ủ, và cũng lượng máu đó tiêu thụ khoảng sáu mươi lăm phần trăm. Các tế bào không có gì thay đổi. Chỉ có dung dịch thay đổi.

Con số đó đến từ một bài báo năm 1928 của George Harrop và E. S. Guzman Barron tại Johns Hopkins, và là nguồn gốc của nhận định được nhắc lại rộng rãi rằng xanh methylen cải thiện hô hấp tế bào. Nhận định ấy không sai, nhưng phạm vi của nó hẹp hơn điều người ta thường hiểu.

Con số trong bảng thực sự đo điều gì

Chỉ tiêu đo là lượng oxy hấp thu, được xác định bằng phân tích khí. Harrop và Barron lọc máu vừa lấy qua bông ở 10 °C để loại bạch cầu, bão hòa mẫu bằng oxy, chia mẫu, thêm thuốc nhuộm vào một phần, rồi phân tích cả hai sau khi ủ. Số lượng bạch cầu hiếm khi vượt quá khoảng một nghìn trên mỗi milimét khối. Lượng oxy tiêu thụ được báo cáo dưới dạng tỷ lệ oxy ban đầu của mẫu đã biến mất.

Họ cũng đo carbon dioxide, nhưng ở đây phương pháp lại gây khó khăn. Máu đã loại fibrin giải phóng tới hai milimol carbon dioxide trên mỗi 100 mL trong giờ ủ đầu tiên vì những lý do không liên quan đến phản ứng đang nghiên cứu, khiến các thương số hô hấp từ máu toàn phần không thể sử dụng được. Chỉ các tế bào đã rửa trong dung dịch Locke mới cho số liệu có thể diễn giải, và những số liệu đó tập trung trong khoảng 0.73 đến 0.80, cả khi có và không có thuốc nhuộm.

Chi tiết đó không phải chuyện vụn vặt. “Hô hấp” trong những bài báo này có nghĩa là trao đổi khí trong một bình kín. Khoảng cách giữa tiêu thụ oxy và năng lượng hữu ích được tạo ra được xem xét riêng trong bài tiêu thụ oxy cho biết và không cho biết điều gì về ATP.

Thuốc nhuộm làm tăng nhiều nhất ở những tế bào hô hấp ít nhất

Hồng cầu trưởng thành của động vật có vú gần như không có mức tiêu thụ oxy đo được. Hồng cầu có nhân của chim thì có. Harrop và Barron thử nghiệm cả hai, và sự tương phản này là nền tảng cho lập luận của họ.

Trong các mẫu máu động vật có vú, thuốc nhuộm làm tăng mức tiêu thụ từ hai mươi đến năm mươi lần. Trong máu ngỗng, nơi các tế bào vốn đã hô hấp, mức tăng không bao giờ vượt quá hai lần. Mức hô hấp ban đầu càng cao, thuốc nhuộm càng ít có khả năng làm tăng thêm.

Cùng một xu hướng đó xuất hiện ngay trong một loài. Một mẫu máu người từ bệnh nhân đa hồng cầu nguyên phát, có chứa các tế bào chưa trưởng thành, tiêu thụ 11.3 phần trăm lượng oxy khi không có thuốc nhuộm, so với 2.8 phần trăm ở các tế bào đã rửa từ một người hiến khỏe mạnh. Thuốc nhuộm chỉ đưa mức đó lên 63.4 phần trăm, tức tăng gấp sáu lần, trong khi các tế bào bình thường tăng gần ba mươi lần. Thuốc nhuộm khiến tế bào trưởng thành hoạt động gần giống tế bào chưa trưởng thành hơn, đúng như cách các tác giả mô tả tác dụng của nó.

Lẽ ra xyanua phải ngăn được quá trình này

Xyanua được biết là có khả năng ngăn quá trình oxy hóa tế bào. Harrop và Barron vẫn thêm nó vào cùng với thuốc nhuộm.

Kết quả trên máu bò là ví dụ tiêu biểu. Hàm lượng oxy giảm từ 22.61 xuống 22.03 phần trăm thể tích sau ba giờ khi không thêm chất nào. Với xanh methylen, hàm lượng này giảm xuống 12.84. Với xanh methylen và kali xyanua ở nồng độ một phần năm nghìn mol trên lít, nó giảm xuống 12.74. Tác dụng của thuốc nhuộm hầu như không bị ảnh hưởng.

Hình: bản ghi vi hô hấp liên tục của hồng cầu người. Mũi tên đánh dấu thời điểm thêm xanh methylen. Trước đó, đường ghi gần như nằm ngang; sau đó, nó tăng đều. Sao lại từ Harrop và Barron, Journal of Experimental Medicine 48:207–223 (1928), PMID 19869478.

Họ kết luận rằng thuốc nhuộm đóng vai trò chất mang oxy, “cung cấp một chất đã biến mất khỏi hồng cầu không nhân trưởng thành của động vật có vú”. Hai năm sau, Michaelis và Salomon tại Viện Rockefeller đã định hình bất đồng này theo cách vẫn còn tồn tại đến nay. Hoặc tác dụng của thuốc nhuộm là “một đặc tính ngẫu nhiên của thuốc nhuộm”, hoặc thuốc nhuộm là “một mô hình cho chất chưa biết nào đó trong các sinh vật”. Hai khả năng đó vẫn chưa được phân định. Điều đã thay đổi là giờ đây có thể mô tả các tế bào chính xác hơn nhiều.

Một dịch chiết gan cũng có tác dụng tương tự

Michaelis và Salomon cho thấy dịch chiết các cơ quan bằng nước lạnh tạo ra mức kích thích tương tự. Gan chuột cống có tác dụng mạnh nhất, tiếp theo là thận, lách và tinh hoàn. Não, cơ và huyết thanh có rất ít hoặc không có tác dụng.

Sau đó, họ thử xem carbon monoxide có ảnh hưởng đến tác dụng của dịch chiết hay không. Hô hấp do dịch chiết hoặc thuốc nhuộm gây ra không thay đổi trong hỗn hợp gồm 98 phần trăm carbon monoxide và 2 phần trăm oxy. Cùng hỗn hợp khí đó ức chế hô hấp của nấm men và hồng cầu có nhân của gia cầm khoảng 60 đến 80 phần trăm, phù hợp với mô tả của Warburg về một enzym hô hấp nhạy với carbon monoxide. Vì vậy, chất chưa xác định trong mô không phải là enzym của Warburg.

Trong quá trình đó, một số chất được đề xuất đã bị loại trừ. Glutathione dạng khử và cysteine chỉ tạo ra mức tiêu thụ oxy cần thiết cho quá trình oxy hóa của chính chúng. Coenzym của Harden và Young bị loại trừ vì cơ chứa chất này nhiều nhất nhưng lại cho tác dụng gần như thấp nhất. Cytochrome của Keilin, được đặt tên vài năm trước đó, cũng gặp cùng mâu thuẫn. Chính họ gọi đề xuất của mình, rằng chất có hoạt tính đến từ nhân tế bào, là một gợi ý đơn thuần.

Tác dụng này đi kèm những điều kiện

Các tế bào phải còn nguyên vẹn. Tan máu do nước cất hoặc đông lạnh nhiều lần làm mất đáp ứng với cả thuốc nhuộm lẫn dịch chiết, còn tan máu một phần làm giảm đáp ứng theo tỷ lệ tương ứng.

Đường cũng là điều kiện cần thiết. Glucose, fructose và sucrose hỗ trợ hô hấp do thuốc nhuộm gây ra; mannitol thì không. Khi không có đường, hoàn toàn không có hô hấp, và thuốc nhuộm dường như làm tổn thương tế bào trong quá trình đó, nên glucose được thêm sau một hoặc hai giờ cũng không khôi phục được hô hấp. Các tác giả cho rằng thuốc nhuộm đang oxy hóa một thành phần cấu trúc mà tế bào cần.

Chiếu sáng làm tăng đáng kể tác dụng của thuốc nhuộm, dù tác dụng vẫn rõ ràng trong bóng tối. Các thuốc nhuộm khác có thể bị khử lại biểu hiện khác nhau: xanh toluylene có tác dụng bằng hoặc vượt xanh methylen, trong khi indigo disulfonate gần như không có tác dụng. Không xuất hiện mối liên hệ rõ ràng giữa thế oxy hóa–khử của một thuốc nhuộm và mức độ tác dụng của nó; các tác giả cho rằng điều này liên quan đến khả năng thấm qua màng và độc tính.

Tác dụng đi cùng mức lên men, không phải mức hô hấp

Nghiên cứu năm 1930 của Barron chuyển từ huyền phù tế bào sang các lát mô của cơ quan bình thường ở chuột cống và các khối u được cấy ghép.

Ở những mô không có đường phân hiếu khí, xanh methylen không có tác dụng hoặc làm giảm nhẹ tiêu thụ oxy: thận khoảng 14 phần trăm, tụy khoảng 14 phần trăm, gan khoảng 5 phần trăm. Ở những mô lên men khi có oxy, nó làm tăng tiêu thụ: lách khoảng 8 phần trăm, não khoảng 13 phần trăm. Mức tăng ở các khối u dao động từ khoảng 27 phần trăm trong ung thư biểu mô vú người đến hơn 80 phần trăm trong sarcoma Rous ở gà, gần như tỷ lệ thuận với mức đường phân hiếu khí của từng mô.

Hình: mỗi điểm là một loại mô. Trục hoành là đường phân hiếu khí; trục tung là thay đổi tiêu thụ oxy sau khi thêm xanh methylen. Dữ liệu từ Barron, Journal of Experimental Medicine 52:447–456 (1930), Bảng 6, PMID 19869777.

Thí nghiệm với xyanua sau đó tạo ra kết quả đối xứng với quan sát trước. Khi hô hấp ở những mô trước đó không đáp ứng bị xyanua chặn lại và hoạt động lên men trở nên rõ rệt, thuốc nhuộm lại làm tăng tiêu thụ oxy: thận khoảng 59 phần trăm, gan khoảng 19 phần trăm, lách khoảng 286 phần trăm, tinh hoàn khoảng 200 phần trăm.

Barron đề xuất rằng thuốc nhuộm có thể dùng để kiểm tra khả năng lên men của tế bào hoặc mô, và kết thúc bằng một suy đoán: nuôi cấy khối u qua nhiều thế hệ trong môi trường chứa thuốc nhuộm có thể một ngày nào đó khiến chuyển hóa của khối u trở nên giống mô bình thường một cách lâu dài. Đó là một câu hỏi nghiên cứu được viết vào năm 1930. Nó không phải là khẳng định về điều trị.

Những điều các thí nghiệm này không thể đo được

Vào năm 1928 và 1930, “hô hấp” có nghĩa là tiêu thụ oxy. Adenosine triphosphate được báo cáo lần đầu vào năm 1929, và đến năm 1949 mới có bằng chứng cho thấy ty thể được phân lập ester hóa phosphate trong khi truyền electron. Không bài báo ban đầu nào về xanh methylen có thể đo sự tạo năng lượng, và cũng không bài nào tuyên bố đã làm điều đó.

Các tế bào là vấn đề thứ hai. Hồng cầu trưởng thành của động vật có vú không chứa ty thể. Trong giai đoạn hồng cầu lưới, chúng loại bỏ ty thể và ribosome bằng cơ chế tự thực bào chọn lọc; đó là lý do hồng cầu trưởng thành vận hành nhờ đường phân và phụ thuộc vào con đường pentose phosphate chủ yếu để tạo NADPH thay vì ATP. Trong các thí nghiệm năm 1928, không có chuỗi vận chuyển electron nào để sửa chữa. Bất kể quá trình nào đã tiêu thụ oxy, nó đang làm một việc khác.

Quá trình khác đó là gì hiện đã được mô tả tương đối rõ. Xanh methylen nhận electron từ các đương lượng khử trong tế bào và trở thành leucomethylene blue, rồi chất này được oxy phân tử oxy hóa trở lại, khép kín chu trình. Trong hồng cầu người, flavin reductase phụ thuộc NADPH và các disulfide reductase liên quan thực hiện bước khử. Một nghiên cứu năm 1976 dùng glucose đánh dấu cho thấy thuốc nhuộm kích thích con đường hexose monophosphate, tác dụng ở nồng độ thấp phụ thuộc vào oxyhemoglobin, còn nồng độ cao hơn, 0.1 mM, tạo ra hydrogen peroxide. Thuốc nhuộm ở dạng khử gặp oxy sẽ tạo peroxide, không phải các liên kết phosphate.

Trong ty thể, bức tranh còn nhiều tranh luận hơn những bản tóm tắt phổ biến thường thừa nhận. Một hướng nghiên cứu cho rằng thuốc nhuộm lấy electron từ vùng phức hợp I và chuyển chúng cho cytochrome c. Một hướng khác phát hiện rằng trong ty thể não chuột nhắt, nó không thể khôi phục hô hấp sau khi bị antimycin chặn, và thay vào đó xác định vị trí nhận electron là vị trí gắn ubiquinol của phức hợp III. Hướng thứ ba phát hiện rằng nồng độ thấp làm tăng tiêu thụ oxy ở trạng thái nghỉ nhưng không làm thay đổi hô hấp được ADP kích thích. Phát biểu trực tiếp nhất về điểm này là tiêu thụ oxy do xanh methylen gây ra hoàn toàn không phụ thuộc vào phosphoryl hóa oxy hóa: nó vẫn tiếp diễn khi chuỗi hô hấp bị ức chế, và trong các chế phẩm không có chuỗi này.

Cũng có những phép đo trực tiếp về khoảng cách giữa hai đại lượng đó. Trong ty thể gan chuột cống được phân lập, nồng độ thuốc nhuộm tăng làm giảm các tỷ số kiểm soát hô hấp và gây trương nở, được các tác giả mô tả là sự tách ghép phosphoryl hóa oxy hóa. Trong gan chuột cống được tưới dịch, xanh methylen làm tăng tiêu thụ oxy trong khi tỷ số ATP trên ADP giảm.

Các ghi nhận lâm sàng cũng mang cùng thông điệp. Tình trạng methemoglobin máu được điều trị bằng khoảng một đến hai miligam xanh methylen trên mỗi kilôgam, theo đường tĩnh mạch, thông qua một con đường khử phụ thuộc NADPH, còn liều lớn hơn lại gây ra chính tình trạng đang được điều trị. Cùng bài tổng quan đó lưu ý rằng tác dụng giải độc mạnh nhất ở hồng cầu nguyên vẹn và giảm khi có tan máu; đây chính là phát hiện về tan máu năm 1930 xuất hiện trở lại bảy mươi ba năm sau trong bối cảnh bệnh viện. Một hợp chất có tác dụng hữu ích và có hại nằm ở hai phía của một ngưỡng liều không phải là hợp chất mà liều dùng nên được suy ra từ phép đo tiêu thụ oxy.

Vì sao lô sản phẩm cần được đưa vào thảo luận

Harrop và Barron nhận thấy một điều đáng đọc lại. Bản thân xanh methylen tạo ra một dải trong quang phổ kế, nằm giữa hai dải đặc trưng của methemoglobin, “có thể dễ dàng gây nhầm lẫn khi quan sát sơ qua”. Thuốc nhuộm có thể bắt chước chất đang được tìm kiếm.

Vấn đề tương tự cũng tồn tại ở phương diện hóa học. Một phenothiazine liên quan hiện diện với hàm lượng nhỏ có đặc tính oxy hóa–khử, khả năng thấm và độc tính riêng. Một trường hợp được ghi nhận cho thấy rõ hệ quả: trong một nghiên cứu về iod hóa xanh methylen, các mẫu chứa khoảng 7 đến 8 phần trăm Azure B tạo ra chủ yếu Azure B được iod hóa, nên chính tạp chất chứ không phải xanh methylen chi phối phản ứng.

Bất kỳ ai sử dụng xanh methylen làm thuốc thử, trong phòng thí nghiệm, tại bàn nhuộm mẫu hoặc trong bể cá, đều đang làm việc với một thành phần chưa được xác định rõ nếu lô sản phẩm chưa được phân tích đặc tính. Các chất liên quan, định tính, tạp chất nguyên tố, dung môi tồn dư và cặn sau nung là một phần của thí nghiệm, chứ không phải giấy tờ bên lề. Blupreme lấy xanh methylen từ một nhà sản xuất dược phẩm và công bố phiếu phân tích đầy đủ, kiểm nghiệm toàn bộ chỉ tiêu USP thay vì chỉ kim loại nặng; hướng dẫn đọc phiếu phân tích và bài nhãn cấp USP xác nhận và không xác nhận điều gì trình bày cách đối chiếu tài liệu với tuyên bố.

Con số đó là đúng

Các thí nghiệm năm 1928 và 1930 được thực hiện cẩn thận, và quan sát cốt lõi của chúng vẫn đứng vững: một thuốc nhuộm có thể bị khử có thể khiến tế bào gần như không hô hấp tiêu thụ oxy ở tốc độ cao gấp nhiều lần mức nghỉ, mà không đi qua bước bị xyanua chặn.

Sai lầm xuất hiện về sau, khi “hô hấp” được hiểu theo nghĩa hiện đại. Một phép đo trao đổi khí cho biết electron đã đến oxy. Nó không cho biết có electron nào được dùng để tạo ATP hay không, và trong một tế bào không có ty thể, khoảng cách giữa hai phát biểu đó lớn đến mức tối đa. Bản đồ tổng quan về những gì xanh methylen thực hiện trong tế bào đặt cùng sự phân biệt này trong một khung rộng hơn, còn lịch sử của hợp chất từ thuốc nhuộm đến thuốc chữa bệnh giải thích vì sao một chất tạo màu cho vải lại có mặt trong những thí nghiệm này ngay từ đầu.