Lịch sử methylene blue: từ thuốc nhuộm đến y học và nghiên cứu

Methylene blue đến với một bệnh nhân trước khi đến với một hiệu thuốc.

Báo cáo năm 1891 của Paul Guttmann và Paul Ehrlich về việc sử dụng thuốc nhuộm này trong sốt rét có hai biểu đồ nhiệt độ. Biểu đồ thứ hai kéo dài từ 13 July đến 5 August, với phương pháp điều trị được ghi dọc theo lề theo từng ngày. Các mục vào 18 và 19 July ghi "1 × 0,05 Methylenblau". Những ngày tiếp theo ghi năm và bảy liều với cùng lượng, và đến 22 July, một lượng nhỏ quinine đã được bổ sung vào hồ sơ. Đường sốt, dao động giữa 37 °C và 39.5 °C trong nửa đầu biểu đồ, trở nên phẳng sau khi thuốc nhuộm xuất hiện và duy trì trong khoảng 36 °C đến 37.5 °C trong ba tuần còn lại.

Bệnh nhân là một trong hai người, được mô tả trong bài báo là một người giúp việc gia đình và một thủy thủ. Hợp chất họ nhận đã là một thuốc nhuộm dệt thương mại trong mười lăm năm, và hai người đàn ông này nằm trong số những người đầu tiên được ghi nhận là được điều trị bằng một loại thuốc hoàn toàn tổng hợp nhắm đến một sinh vật cụ thể.

Thuốc nhuộm xuất hiện trước

Thuốc nhuộm tổng hợp thành công về mặt thương mại đầu tiên được William Henry Perkin tạo ra vào năm 1856. Perkin khi đó mười tám tuổi, làm việc trong một phòng thí nghiệm tại nhà trong kỳ nghỉ Easter và đang cố gắng tổng hợp quinine. Thay vào đó, ông thu được một cặn màu đen, hòa tan nó và phát hiện một màu bám rất đẹp trên lụa. Ông đăng ký bằng sáng chế vào August 1856 và đến cuối năm 1857 đã có một nhà máy cung cấp cho một cơ sở nhuộm lụa ở London.

Năm 1875 Adolf von Baeyer tổng hợp một thuốc nhuộm đỏ và đặt tên là eosin, theo Eos, từ tiếng Hy Lạp chỉ bình minh. Năm 1876 Heinrich Caro, khi đó là giám đốc phòng thí nghiệm tại Badische Anilin- und Soda-Fabrik, cùng Baeyer phát triển methylene blue thành một thuốc nhuộm gốc aniline cho cotton. Cấu trúc hóa học của nó phải đến khoảng chín năm sau mới được xác định.

Nguồn gốc đó vẫn thể hiện trong cách chất này được gọi tên. "Methylene blue" là một tên thương mại từ danh mục thuốc nhuộm, không phải một mô tả hóa học. Hợp chất mà tên này chỉ đến là methylthioninium chloride, và sự khác biệt giữa tên gọi, muối và các dạng hydrate của nó trở nên quan trọng ngay khi ai đó cân vật liệu hoặc đọc một tiêu chuẩn kỹ thuật.

Nhuộm tiêu bản là cầu nối

Con đường từ xưởng nhuộm đến bệnh viện đi qua kính hiển vi, và nó bắt đầu trước khi methylene blue tồn tại. Wilhelm Erb là người đầu tiên áp dụng thuốc nhuộm tổng hợp lên máu, sử dụng picric acid vào năm 1865, và quan sát thấy một cấu trúc dạng lưới bên trong một số hồng cầu.

Luận án tiến sĩ năm 1878 của Paul Ehrlich so sánh nhuộm mô học với nhuộm vải và lập luận rằng cả hai đều là phản ứng hóa học. Khi làm việc dưới quyền Robert Koch về trực khuẩn lao, ông phân loại thuốc nhuộm aniline thành nhóm acid và basic, đồng thời xác lập rằng mỗi nhóm nhuộm màu những phần khác nhau của tế bào. Năm 1880 ông trộn hai loại với nhau: một dung dịch methylene blue bão hòa được đổ vào acid fuchsin cho đến khi phần dịch nổi trở nên trong. Kết quả, mà ông gọi là neutralen Farbkörper hay thuốc nhuộm trung tính, tạo ra ba màu thay vì một, làm lộ các hạt trong tế bào đa nhân mà trước đó không nhìn thấy được, và giúp thực hiện phép đếm phân biệt bạch cầu đầu tiên. Vì các hạt này hấp thu cả hai thành phần của hỗn hợp, Ehrlich đặt ra từ neutrophil cho những tế bào mang chúng.

Hai năm sau Koch sử dụng methylene blue để tìm trực khuẩn lao, và năm 1883 Ehrlich cải tiến phương pháp. Năm 1886 ông công bố một kiểu quan sát khác: ông tiêm thuốc nhuộm vào động vật sống và so sánh mức độ hấp thu của từng cơ quan, rồi kết luận rằng nó có ái lực rõ rệt với mô não và thần kinh. Ông quy ái lực đó cho chu trình oxy hóa-khử của thuốc nhuộm, hiện tượng mà ông đã quan sát từ năm trước. Chu trình đó cũng là lý do dung dịch methylene blue mất màu khi oxygen bị tiêu thụ và lấy lại màu khi không khí quay trở lại. Các thí nghiệm đầu tiên đo lường hệ quả của chu trình đó thuộc về một thập kỷ sau, còn bản thân cơ chế là một chủ đề riêng biệt với lịch sử.

Ký sinh trùng và nhân màu tím

Alphonse Laveran phát hiện ký sinh trùng sốt rét vào năm 1880 bằng cách kiểm tra máu tươi, không nhuộm. Để quan sát nó thường quy trong một tiêu bản khô cần có thuốc nhuộm, và các phương pháp nhuộm thời đó chỉ tạo ra màu đỏ và xanh lam.

Năm 1888 nhà bệnh học người Ba Lan Czesław Cheçinski thay acid fuchsin bằng eosin, tạo ra hỗn hợp methylene blue và eosin. Ca bệnh đứng sau phương pháp của ông là một người lính tử vong vì sốt rét vào 30 September 1887. Trong các tiêu bản máu, Cheçinski nhìn thấy các dạng màu xanh giống hoa cúc, nay được xác định là Plasmodium malariae, và các dạng hình liềm, nay được xác định là giao bào của Plasmodium falciparum. Kết quả này cùng lúc chấm dứt hai cách giải thích cạnh tranh về căn bệnh: thuyết chướng khí và tuyên bố của Edwin Klebs cùng Corrado Tommasi-Crudeli rằng sốt rét do một vi khuẩn gây ra.

Ký sinh trùng đã nhìn thấy được. Nhân của nó thì chưa, khiến bản chất của nó vẫn còn bỏ ngỏ. Ernst Malachowski, một bác sĩ ở Breslau, giải quyết vấn đề đó trước tiên bằng tình cờ rồi sau đó có chủ đích. Ông nhận thấy sự nhuộm phân biệt của nhân plasmodium trong một tiêu bản vào năm 1889 nhưng không thể tái tạo kết quả. Acid hóa methylene blue không giúp ích. Kiềm hóa nó bằng borax tạo ra hiệu ứng này mọi lần. Ông trình diễn công khai kỹ thuật vào 15 June 1890 và công bố nó cùng năm, với một phương pháp đầy đủ hơn vào August 1891.

Dmitri Romanowsky công bố phiên bản riêng vào September 1891. Kết quả tốt nhất của ông đến từ một chai dung dịch methylene blue bị bỏ quên, đã mốc và hơn hai tháng tuổi. Mô tả của Malachowski là có chủ đích và, theo lời ông, dễ tái lập; phương pháp của Romanowsky là một ngõ cụt chỉ hoạt động một lần. Dẫu vậy, tên gọi theo người lại thuộc về Romanowsky, và tranh chấp về việc ai đã tạo ra màu tím làm cho nhân trở nên nhìn thấy được là một câu chuyện riêng với các tài liệu riêng.

Hình: biểu đồ nhiệt độ thứ hai từ báo cáo năm 1891 của Guttmann và Ehrlich. Phần trên bao quát từ 13 đến 24 July và phần dưới từ 25 July đến 5 August; các mục ở lề ghi tên những liều đã dùng, và nhiệt độ duy trì gần mức bình thường trong ba tuần cuối của hồ sơ. Sao lại từ báo cáo được quét cho Krafts, Hempelmann và Skórska-Stania, Parasitology Research 111:1–6 (2012), PMID 22411634.

“Ủ chín” hóa ra là quá trình khử methyl

Không ai tham gia vào những năm 1890 biết quá trình "ủ chín" đã làm gì với methylene blue. Câu trả lời xuất phát từ hóa học công nghiệp. Heinrich August Bernthsen đã tổng hợp hợp chất mẹ phenothiazine vào năm 1883, xác lập vào năm 1885 rằng methylene blue thuộc họ này, và trong cùng giai đoạn cho thấy điều kiện kiềm loại các nhóm methyl khỏi thuốc nhuộm, tạo ra những hợp chất ngày nay được gọi là các azure.

Bernard Nocht chiết xuất phần hoạt tính vào năm 1898 và 1899 và chỉ có thể gọi nó là Rot aus Methylenblau, màu đỏ từ methylene blue. Michaelis xác định nó là azure I vào năm 1901. Jenner đưa absolute methanol vào làm dung môi cho kết tủa thuốc nhuộm vào năm 1899, loại bỏ nhu cầu cố định tiêu bản máu bằng nhiệt; Leishman và Reuter kết hợp cả hai cải tiến; Wright công bố một phương pháp đơn giản hóa vào năm 1902. Đóng góp của Giemsa, cũng vào năm 1902, là ngừng phụ thuộc vào dung dịch được ủ chín ngẫu nhiên và thay vào đó sử dụng lượng đã đo của các thuốc nhuộm đã biết. Sau đó ông từ chối công bố cách mình tạo ra methylene azure tinh khiết và bán phương pháp cho phòng thí nghiệm của Dr. Grübler, nơi tiếp thị sản phẩm dưới tên azure I và tuyên bố rằng chỉ phiên bản của họ mới là thuốc nhuộm Giemsa chính hiệu.

Hai cuộc thế chiến vô tình hoàn tất công việc. Khi thuốc nhuộm của Đức không còn mua được, Lillie, Roe và Wilcox nghiên cứu các chất thay thế của Mỹ và phát hiện rằng khả năng nhuộm tốt nhất đến từ ba thành phần tách biệt: methylene blue tinh khiết, sản phẩm phân hủy của nó là azure B, và eosin. Ba thành phần đó vẫn là các thành phần chính của thuốc nhuộm được dùng để chẩn đoán sốt rét ngày nay, dưới một tên gọi hiện kết hợp Malachowski, Wright và Giemsa.

Hình: các thể vòng của Plasmodium falciparum trong hồng cầu người, được nhuộm bằng phương pháp kiểu Romanowsky. Cấu trúc màu tím bên trong vòng là chromatin mà methylene blue xử lý bằng borax của Malachowski đã làm cho nhìn thấy được lần đầu tiên. Hình ảnh của Ernst Hempelmann, được phát hành vào phạm vi công cộng.

Một tên gọi, nhiều vật liệu

Những năm phân tách các thành phần đó để lại một vấn đề tồn tại lâu hơn cả phần hóa học. Ralph Lillie năm 1969 đã vạch ra ranh giới giữa thuốc nhuộm sinh học, "được sản xuất theo các thông số kỹ thuật nghiêm ngặt tương xứng với những ứng dụng tinh tế và khắt khe của chúng", và thuốc nhuộm phi sinh học dùng để nhuộm vải, vốn "đòi hỏi các tiêu chuẩn sản xuất ít nghiêm ngặt và khắt khe hơn". Cả hai loại sản phẩm đều mang cùng một tên, và sự khác biệt giữa chúng chưa bao giờ chỉ là khác biệt về mức độ. Một tiêu chuẩn kỹ thuật viết cho cotton và một tiêu chuẩn kỹ thuật viết cho thuốc thử chẩn đoán không thể thay thế cho nhau, và vật liệu được sản xuất theo tiêu chuẩn dành cho dệt may không được tạo ra để nuốt vào.

Azure B là minh họa rõ nhất. Nó là dạng monodemethyl hóa của methylene blue, có hoạt tính dược lý có thể đo lường riêng, và đã hiện diện như một thành phần không được kiểm soát trong các chế phẩm methylene blue lâm sàng hơn một thế kỷ trước khi có người tách hai chất này ra. Một nhóm phát hiện rằng mô người lấy mẫu khi khám nghiệm tử thi sau khi dùng methylene blue chứa 5 đến 14 per cent methylene blue không thay đổi và 86 đến 95 per cent azure B. Một chế phẩm cụ thể có nên chứa azure B hay không, và giới hạn ở mức nào, là một câu hỏi về tiêu chuẩn kỹ thuật, và nghiên cứu về azure B như một tạp chất và chất chuyển hóa tiếp tục từ đó.

Tiêu chuẩn kỹ thuật cũng là nơi hệ quả thực tế được thể hiện. Việc đáp ứng USP là con đường để đạt mức độ tinh khiết cao nhất mà thị trường cung cấp, vì đây là một tiêu chuẩn thử nghiệm hoàn chỉnh được công bố chứ không phải một phép đo đơn lẻ. Nó bao gồm định danh, assay, tạp chất hữu cơ bao gồm các thuốc nhuộm azure, dung môi tồn dư, tạp chất nguyên tố, cặn sau nung, giới hạn vi sinh và nội độc tố vi khuẩn. Một chứng nhận chỉ báo cáo kết quả kim loại nặng rồi gọi đó là tuân thủ USP mới chỉ báo cáo một dòng trong danh sách này.

Blupreme lấy methylene blue từ một nhà sản xuất dược phẩm và công bố đầy đủ certificate of analysis, kiểm nghiệm toàn bộ tiêu chuẩn USP thay vì chỉ riêng kim loại nặng. Hướng dẫn cách đọc certificate of analysis và những gì định danh USP xác lập và không xác lập giải thích cách đối chiếu tài liệu với tuyên bố.

Lịch sử cho phép kết luận điều gì, và không cho phép điều gì

Dòng lịch sử này là có thật, và dài hơn những gì phần lớn trang sản phẩm thể hiện. Methylene blue được dùng điều trị sốt rét vào năm 1891, được báo cáo như một thuốc an thần trong chứng loạn thần kích động vào năm 1899, và nhánh hóa học của nó kéo dài qua quinacrine, chloroquine, promethazine và chlorpromazine. Bài báo năm 1890 của Ehrlich cùng Arthur Leppmann mô tả việc giảm đau do neuralgia và rheumatism, sau đó cân nhắc nhưng quyết định không thử nghiệm thuốc nhuộm này trong bệnh tâm thần.

Không điều nào trong số đó xác lập một công dụng hiện đại. Kết quả sốt rét năm 1891 chỉ gồm hai bệnh nhân và một biểu đồ nhiệt độ. Việc một phân tử đã được biết đến từ lâu là lý do để nghiên cứu nó, không phải là một kết quả. Lịch sử của hợp chất với tư cách một loại thuốc và các thử nghiệm hiện đại về sốt rét trả lời những câu hỏi khác với những gì Ehrlich đang đặt ra, và các tiêu chí đánh giá phải được đọc theo chính cách chúng được định nghĩa.

Có một chi tiết trong hồ sơ thuộc về hiện tại hơn là quá khứ. Khi các nhà nghiên cứu tiến hành thử nghiệm methylene blue cho sốt rét tại Burkina Faso trong những năm 2000, họ phải cạnh tranh để có vật liệu cấp dược phẩm và báo cáo rằng giá nguyên liệu thô đã tăng khoảng một trăm lần sau khi có xác nhận GMP. Một thuốc nhuộm có thể được thay thế. Một loại thuốc thì không. Sự phân biệt mà Lillie đưa ra năm 1969 cũng chính là sự phân biệt quyết định một chai chứa gì ngày nay. :::