Історія метиленового синього: від барвника до ліків і досліджень

Метиленовий синій потрапив до пацієнта раніше, ніж до аптеки.

Звіт 1891 року Паула Гуттмана та Пауля Ерліха про застосування барвника при малярії містить два температурні графіки. Другий охоплює період від 13 липня до 5 серпня, а лікування записано вздовж поля день за днем. Записи за 18 і 19 липня містять "1 × 0,05 Methylenblau". У наступні дні зазначено п'ять і сім доз такої самої кількості, а до 22 липня в записі з'являється невелика кількість хініну. Лінія температури, яка в першій половині графіка коливається між 37 °C і 39.5 °C, після появи барвника вирівнюється і протягом решти трьох тижнів залишається приблизно між 36 °C і 37.5 °C.

Пацієнт був одним із двох чоловіків, описаних у статті як домашній слуга та моряк. Сполука, яку вони отримували, на той момент уже п'ятнадцять років була комерційним текстильним барвником, а ці двоє належать до перших задокументованих людей, яких лікували повністю синтетичним препаратом, спрямованим на конкретний організм.

Спочатку був барвник

Перший комерційно успішний синтетичний барвник створив Вільям Генрі Перкін у 1856 році. Перкіну було вісімнадцять; під час великодніх канікул він працював у домашній лабораторії та намагався синтезувати хінін. Натомість він отримав чорний осад, розчинив його й виявив барвник, який яскраво закріплювався на шовку. Він запатентував його в серпні 1856 року, а до кінця 1857 року вже мав фабрику, що постачала барвник лондонському підприємству з фарбування шовку.

У 1875 році Адольф фон Байєр синтезував червоний барвник і назвав його еозином — від Еос, грецького слова на позначення світанку. У 1876 році Генріх Каро, тодішній директор лабораторії Badische Anilin- und Soda-Fabrik, разом із Байєром розробив метиленовий синій як барвник на основі аніліну для бавовни. Його хімічну структуру остаточно встановили лише приблизно через дев'ять років.

Це походження досі помітне в назві речовини. "Метиленовий синій" — це торгова назва з каталогу барвників, а не хімічний опис. Сполука, яку вона позначає, — хлорид метилтіонінію, і відмінності між назвою, сіллю та її гідратами стають важливими, щойно хтось зважує матеріал або читає специфікацію.

Фарбування стало містком

Шлях із фарбувального виробництва до лікарні проліг через мікроскоп і почався ще до появи метиленового синього. Вільгельм Ерб першим застосував синтетичний барвник до крові, використавши пікринову кислоту в 1865 році, і побачив сітчастий візерунок усередині деяких еритроцитів.

У докторській дисертації Пауля Ерліха 1878 року гістологічне фарбування порівнювалося з фарбуванням текстилю та стверджувалося, що обидва процеси є хімічними реакціями. Працюючи під керівництвом Роберта Коха над туберкульозною паличкою, він розділив анілінові барвники на кислотні й основні класи та встановив, що кожен клас забарвлює різні частини клітини. У 1880 році він змішав два типи: насичений розчин метиленового синього додавали до кислого фуксину, доки надосадова рідина не ставала прозорою. Результат, який він назвав neutralen Farbkörper, або нейтральним барвником, давав три кольори замість одного, виявив гранули в поліморфноядерних клітинах, яких раніше не було видно, і зробив можливим перший диференційний підрахунок лейкоцитів. Оскільки ці гранули поглинали обидва компоненти суміші, Ерліх запровадив слово нейтрофіл для клітин, що їх містили.

Через два роки Кох використав метиленовий синій для виявлення туберкульозної палички, а в 1883 році Ерліх удосконалив метод. У 1886 році він опублікував спостереження іншого типу: вводив барвник живим тваринам, порівнював, наскільки інтенсивно його поглинає кожен орган, і дійшов висновку, що він має виражену спорідненість із тканиною головного мозку та нервовою тканиною. Він пов'язував цю спорідненість з окисно-відновним циклуванням барвника, яке спостерігав попереднього року. Саме через це циклування розчин метиленового синього втрачає колір, коли кисень у ньому вичерпується, і відновлює його після повернення повітря. Експерименти, у яких уперше виміряли наслідки цього циклування, належать уже до наступного десятиліття, а сам механізм — окрема від історії тема.

Паразит і фіолетове ядро

Альфонс Лаверан виявив малярійного паразита в 1880 році, досліджуючи свіжу незабарвлену кров. Щоб регулярно бачити його в висушеному мазку, потрібен був барвник, а тогочасні методи давали лише червоний і синій кольори.

У 1888 році польський патолог Чеслав Хенцінський замінив кислий фуксин еозином, отримавши суміш метиленового синього та еозину. Метод виник із випадку солдата, який помер від малярії 30 вересня 1887 року. У мазках крові Хенцінський побачив сині форми, схожі на маргаритки, які тепер визначають як Plasmodium malariae, а також серпоподібні форми, які нині вважають гаметоцитами Plasmodium falciparum. Результат одночасно поклав край двом конкуруючим поясненням хвороби: міазматичній теорії та твердженню Едвіна Клебса й Коррадо Томмазі-Круделі, що малярію спричиняє бактерія.

Паразита було видно. Його ядро — ні, тому його природа залишалася нез'ясованою. Ернст Малаховський, лікар із Бреслау, розв'язав цю проблему спочатку випадково, а потім цілеспрямовано. У 1889 році він помітив диференційне забарвлення ядра плазмодія в одному препараті, але не зміг відтворити результат. Підкислення метиленового синього не допомогло. Підлужнення бурою давало ефект щоразу. Він публічно продемонстрував метод 15 червня 1890 року й опублікував його того ж року, а в серпні 1891 року представив докладнішу методику.

Дмитро Романовський опублікував власну версію у вересні 1891 року. Найкращі результати він отримав із занедбаної, запліснявілої пляшки розчину метиленового синього, якому було понад два місяці. Опис Малаховського був навмисно розробленим і, за його словами, легко відтворюваним; варіант Романовського був тупиковим випадком, який спрацював один раз. Попри це, епонім дістався Романовському, а суперечка про те, хто отримав фіолетове забарвлення, що зробило ядро видимим, — окрема історія зі своїми документами.

Рисунок: другий температурний графік зі звіту Гуттмана та Ерліха 1891 року. Верхня панель охоплює період від 13 до 24 липня, нижня — від 25 липня до 5 серпня; записи на полях зазначають призначені дози, а протягом останніх трьох тижнів спостереження температура залишається близькою до норми. Відтворено зі звіту в сканованій версії, використаній у Krafts, Hempelmann and Skórska-Stania, Parasitology Research 111:1–6 (2012), PMID 22411634.

Виявилося, що «дозрівання» було деметилюванням

У 1890-х ніхто з учасників досліджень не знав, що саме «дозрівання» робило з метиленовим синім. Відповідь прийшла з промислової хімії. Генріх Август Бернтсен синтезував вихідну сполуку фенотіазин у 1883 році, у 1885 році встановив, що метиленовий синій належить до цієї родини, і в той самий період показав, що лужні умови відщеплюють від барвника метильні групи, утворюючи сполуки, які нині називають азурами.

Бернард Нохт виділив активну фракцію в 1898 і 1899 роках і міг назвати її лише Rot aus Methylenblau — червоне з метиленового синього. У 1901 році Міхаеліс ідентифікував її як azure I. У 1899 році Дженнер запровадив абсолютний метанол як розчинник для осаду барвника, що усунуло потребу у фіксації мазків крові нагріванням; Лейшман і Ройтер поєднали обидва вдосконалення; Райт у 1902 році опублікував спрощений метод. Внесок Гімзи, також у 1902 році, полягав у тому, щоб перестати покладатися на випадково «дозрілий» розчин і натомість використовувати відміряні кількості відомих барвників. Потім він відмовився публікувати спосіб отримання чистого метиленового azure і продав метод лабораторії Dr. Grübler, яка вивела продукт на ринок як azure I та стверджувала, що лише її версія є справжнім забарвленням за Гімзою.

Дві світові війни випадково завершили цю роботу. Коли німецькі барвники стали недоступними, Ліллі, Роу та Вілкокс працювали з американськими замінниками й виявили, що найкраще забарвлення давали три розділені компоненти: чистий метиленовий синій, продукт його розпаду azure B та еозин. Ці три компоненти й сьогодні залишаються основними складовими забарвлення, яке використовують для діагностики малярії, під назвою, що тепер поєднує Малаховського, Райта та Гімзу.

Рисунок: кільцеподібні форми Plasmodium falciparum в еритроцитах людини, забарвлені методом типу Романовського. Фіолетова структура всередині кільця — це хроматин, який метиленовий синій, оброблений бурою за методом Малаховського, уперше зробив видимим. Зображення Ернста Гемпельманна, передане в суспільне надбання.

Одна назва, кілька матеріалів

Роки, протягом яких ці компоненти розділяли, залишили проблему, що пережила самі хімічні питання. У 1969 році Ральф Ліллі провів межу між біологічними барвниками, «виготовленими за жорсткими специфікаціями, що відповідають їх делікатному й вимогливому застосуванню», і небіологічними барвниками для фарбування текстилю, які «потребують менш суворих і вимогливих виробничих стандартів». Обидва типи продукції мали однакову назву, і різниця між ними ніколи не була лише різницею ступеня. Специфікація, написана для бавовни, і специфікація, написана для діагностичного реагенту, не є взаємозамінними, а матеріал, виготовлений за текстильною специфікацією, не призначався для ковтання.

Azure B — найнаочніший приклад. Це монометильована форма метиленового синього, вона має власну вимірювану фармакологічну активність і понад століття була неконтрольованою складовою клінічних препаратів метиленового синього, перш ніж ці дві речовини розділили. Одна група дослідників встановила, що тканина людини, відібрана під час розтину після введення метиленового синього, містила від 5 до 14 per cent незміненого метиленового синього та від 86 до 95 per cent Azure B. Чи має конкретний препарат містити Azure B і якою має бути межа його вмісту — це питання специфікації, а дослідження Azure B як домішки та метаболіту продовжують тему звідси.

Саме в специфікації міститься й практичний наслідок. Відповідність USP — це шлях до найвищої чистоти, яку пропонує ринок, оскільки USP є повним опублікованим стандартом випробувань, а не окремим вимірюванням. Він охоплює ідентичність, кількісний вміст, органічні домішки, включно з барвниками azure, залишкові розчинники, елементні домішки, залишок після прожарювання, мікробіологічні межі та бактеріальні ендотоксини. Сертифікат, у якому наведено результат аналізу на важкі метали й названо це відповідністю USP, фактично повідомляє лише один рядок із цього переліку.

Blupreme отримує метиленовий синій від фармацевтичного виробника та публікує повний сертифікат аналізу, перевіряючи всю специфікацію USP, а не лише важкі метали. Посібник із читання сертифіката аналізу і пояснення того, що позначення USP встановлює, а чого не встановлює описують, як звірити документ із заявленою відповідністю.

Що ця історія дозволяє стверджувати, а що — ні

Історична лінія реальна й довша, ніж випливає з більшості сторінок продуктів. Метиленовий синій застосовували для лікування малярії в 1891 році, у 1899 році повідомляли про його використання як седативного засобу при збудженому психозі, а його бічна хімічна гілка проходить через хінакрин, хлорохін, прометазин і хлорпромазин. У статті Ерліха 1890 року, написаній разом з Артуром Леппманном, описувалося полегшення невралгічного та ревматичного болю, після чого автори розглянули, але вирішили не випробовувати барвник при психічних захворюваннях.

Ніщо з цього не встановлює сучасного застосування. Результат 1891 року щодо малярії — це два пацієнти й температурний графік. Тривале знайомство з молекулою є підставою її вивчати, а не результатом. Історія сполуки як лікарського засобу і сучасні дослідження при малярії відповідають на інші питання, ніж ті, які ставив Ерліх, і їхні кінцеві точки потрібно оцінювати на власних умовах.

У цьому історичному записі є одна деталь, що належить радше до сьогодення, ніж до минулого. Коли у 2000-х роках дослідники проводили випробування метиленового синього при малярії в Буркіна-Фасо, їм довелося конкурувати за матеріал фармацевтичного класу, і вони повідомляли, що ціна сировини зростала приблизно у сто разів після отримання валідації GMP. Барвник можна було замінити. Лікарський засіб — ні. Межа, яку Ліллі провів у 1969 році, — та сама, що й сьогодні визначає, що саме міститься у флаконі. :::