Metilen mavisinin tarihi: boyadan ilaca ve araştırmaya

Metilen mavisi eczaneye ulaşmadan önce bir hastaya ulaştı.

Paul Guttmann ve Paul Ehrlich'in boyanın sıtmada kullanımına ilişkin 1891 tarihli raporunda iki sıcaklık grafiği bulunur. İkincisi 13 July ile 5 August arasını kapsar ve uygulanan tedavi gün gün kenar boşluğuna yazılmıştır. 18 ve 19 July tarihli girişlerde "1 × 0,05 Methylenblau" yazar. Sonraki günlerde aynı miktarın beş ve yedi dozu listelenir ve 22 July itibarıyla kayda küçük bir miktar kinin de eklenmiştir. Grafiğin ilk yarısında 37 °C ile 39.5 °C arasında dalgalanan ateş çizgisi, boya uygulandıktan sonra düzleşir ve kalan üç hafta boyunca yaklaşık 36 °C ile 37.5 °C arasında kalır.

Hasta, makalede ev hizmetlisi ve denizci olarak tanımlanan iki kişiden biriydi. Aldıkları bileşik on beş yıldır ticari bir tekstil boyasıydı ve bu iki erkek, belirli bir organizmayı hedefleyen tamamen sentetik bir ilaçla tedavi edildiği kayda geçmiş ilk kişiler arasındadır.

Önce boya vardı

Ticari başarı elde eden ilk sentetik boya, William Henry Perkin tarafından 1856'da üretildi. Perkin on sekiz yaşındaydı, Paskalya tatilinde evindeki laboratuvarda çalışıyor ve kinin sentezlemeye uğraşıyordu. Bunun yerine siyah bir kalıntı elde etti, onu çözdü ve ipeğe parlak biçimde tutunan bir renk ortaya çıkardı. August 1856'da patentini aldı ve 1857'nin sonunda Londra'daki bir ipek boyahanesine tedarik yapan bir fabrikası vardı.

1875'te Adolf von Baeyer kırmızı bir boya sentezledi ve ona, Yunancada şafak anlamına gelen Eos'tan hareketle eosin adını verdi. 1876'da, o dönemde Badische Anilin- und Soda-Fabrik laboratuvarının yöneticisi olan Heinrich Caro, Baeyer ile birlikte metilen mavisini pamuk için anilin bazlı bir boya olarak geliştirdi. Kimyasal yapısı ancak yaklaşık dokuz yıl sonra kesinleşti.

Bu köken, maddenin adlandırılma biçiminde hâlâ görülebilir. "Metilen mavisi", kimyasal bir tanım değil, boya kataloğundan gelen bir ticari addır. Bu adın ifade ettiği bileşik methylthioninium chloride'dır ve biri maddeyi tartmaya veya bir spesifikasyonu okumaya başladığı anda ad, tuz ve hidratları arasındaki ayrımlar önem kazanır.

Köprüyü boyama kurdu

Boya fabrikalarından hastaneye uzanan yol mikroskoptan geçti ve metilen mavisi var olmadan önce başladı. Wilhelm Erb, 1865'te picric acid kullanarak kana sentetik boya uygulayan ilk kişiydi ve bazı kırmızı hücrelerin içinde retiküler bir desen gördü.

Paul Ehrlich'in 1878 tarihli doktora tezi, histolojik boyamayı tekstil boyamasıyla karşılaştırdı ve her ikisinin de kimyasal reaksiyonlar olduğunu savundu. Robert Koch'un yanında tüberküloz basili üzerinde çalışırken anilin boyalarını asidik ve bazik sınıflara ayırdı ve her sınıfın hücrenin farklı bölümlerini renklendirdiğini ortaya koydu. 1880'de ikisini birbirine karıştırdı: üstte kalan sıvı berraklaşana kadar acid fuchsin içine doymuş bir methylene blue çözeltisi döktü. Neutralen Farbkörper veya nötr boya adını verdiği sonuç, bir renk yerine üç renk üretti, polimorfonükleer hücrelerde daha önce görünmeyen granülleri ortaya çıkardı ve ilk lökosit diferansiyel sayımını mümkün kıldı. Bu granüller karışımın her iki bileşenini de tuttuğu için Ehrlich, onları taşıyan hücreler için neutrophil sözcüğünü türetti.

İki yıl sonra Koch, tüberküloz basilini bulmak için metilen mavisi kullandı ve 1883'te Ehrlich yöntemi geliştirdi. 1886'da farklı türde bir gözlem yayımladı: boyayı canlı hayvanlara enjekte etti, her organın onu ne kadar güçlü biçimde tuttuğunu karşılaştırdı ve beyin ile sinir dokusuna belirgin bir afinitesi olduğu sonucuna vardı. Bu afinitenin, bir önceki yıl gözlemlediği boyanın yükseltgenme-indirgenme döngüsünden kaynaklandığını düşündü. Aynı döngü, bir metilen mavisi çözeltisinin oksijeni tükendiğinde rengini kaybetmesinin ve hava geri geldiğinde rengini yeniden kazanmasının da nedenidir. Bu döngünün sonuçlarını ilk kez ölçen deneyler daha sonraki bir on yıla aittir ve mekanizmanın kendisi tarihten ayrı bir konudur.

Parazit ve mor çekirdek

Alphonse Laveran, 1880'de taze, boyanmamış kanı inceleyerek sıtma parazitini buldu. Onu kurutulmuş bir yaymada düzenli olarak görebilmek için boya gerekiyordu ve dönemin boyaları yalnızca kırmızı ve mavi üretiyordu.

1888'de Polonyalı patolog Czesław Cheçinski, acid fuchsin yerine eosin kullanarak methylene blue ve eosin karışımı oluşturdu. Yönteminin temelindeki vaka, 30 September 1887'de sıtmadan ölen bir askerdi. Kan yaymalarında Cheçinski, bugün Plasmodium malariae olarak tanınan mavi, papatya benzeri biçimler ve bugün Plasmodium falciparum gametositleri olarak tanınan orak biçimli yapılar gördü. Sonuç, hastalığa ilişkin iki rakip açıklamayı aynı anda sona erdirdi: miasma teorisini ve Edwin Klebs ile Corrado Tommasi-Crudeli'nin sıtmanın bir bakteriden kaynaklandığı iddiasını.

Parazit görünüyordu. Çekirdeği ise görünmüyordu ve bu durum yapısının ne olduğu sorusunu açık bırakıyordu. Breslau'da hekim olan Ernst Malachowski, bu sorunu önce tesadüfen, ardından bilinçli olarak çözdü. 1889'da bir preparatta plasmodial çekirdeğin diferansiyel boyandığını fark etti ancak bunu yeniden oluşturamadı. Methylene blue'yu asitleştirmek işe yaramadı. Boraksla alkalileştirmek ise etkiyi her seferinde oluşturdu. Tekniği 15 June 1890'da halka açık biçimde gösterdi ve aynı yıl yayımladı; daha ayrıntılı yöntemi ise August 1891'de yayımlandı.

Dmitri Romanowsky kendi versiyonunu September 1891'de yayımladı. En iyi sonuçlarını, iki aydan eski, ihmal edilmiş ve küflenmiş bir methylene blue çözeltisi şişesinden aldı. Malachowski'nin yöntemi bilinçliydi ve kendi ifadesiyle kolayca tekrarlanabiliyordu; Romanowsky'ninki ise bir kez işe yarayan çıkmaz bir yoldu. Buna rağmen eponim Romanowsky'ye gitti ve çekirdeği görünür kılan mor rengi kimin ürettiğine ilişkin anlaşmazlık kendi belgeleri olan ayrı bir hikâyedir.

Şekil: Guttmann ve Ehrlich'in 1891 tarihli raporundaki ikinci sıcaklık grafiği. Üst panel 13 ile 24 July arasını, alt panel ise 25 July ile 5 August arasını kapsar; kenar girişlerinde verilen dozlar belirtilir ve sıcaklık kaydın son üç haftasında normale yakın kalır. Krafts, Hempelmann ve Skórska-Stania için taranan rapordan yeniden üretilmiştir, Parasitology Research 111:1–6 (2012), PMID 22411634.

Olgunlaşmanın aslında demetilasyon olduğu ortaya çıktı

1890'larda sürece dahil olan hiç kimse "olgunlaşmanın" metilen mavisine ne yaptığını bilmiyordu. Yanıt endüstriyel kimyadan geldi. Heinrich August Bernthsen, ana bileşik phenothiazine'ı 1883'te sentezlemiş, 1885'te metilen mavisinin bu aileye ait olduğunu belirlemiş ve aynı dönemde alkali koşulların boyadan metil gruplarını ayırarak bugün azures olarak adlandırılan bileşikleri oluşturduğunu göstermişti.

Bernard Nocht etkin fraksiyonu 1898 ve 1899'da ayırdı ve ona yalnızca Rot aus Methylenblau, yani metilen mavisinden kırmızı, adını verebildi. Michaelis 1901'de bunun azure I olduğunu belirledi. Jenner, 1899'da boya çökeltisi için çözücü olarak absolute methanol kullanmaya başladı ve böylece kan yaymalarını ısıyla fikse etme gereksinimini ortadan kaldırdı; Leishman ve Reuter her iki ilerlemeyi birleştirdi; Wright 1902'de basitleştirilmiş bir yöntem yayımladı. Yine 1902'de Giemsa'nın katkısı, rastgele olgunlaşmış bir çözeltiye güvenmeyi bırakıp bunun yerine bilinen boyaların ölçülmüş miktarlarını kullanmaktı. Daha sonra saf methylene azure'u nasıl ürettiğini yayımlamayı reddetti ve yöntemi ürünü azure I olarak pazarlayan ve yalnızca kendi versiyonunun gerçek Giemsa boyası olduğunu iddia eden Dr. Grübler laboratuvarına sattı.

İki dünya savaşı işi tesadüfen tamamladı. Alman boyaları temin edilemez hâle geldiğinde Lillie, Roe ve Wilcox Amerikan alternatifleri üzerinde çalıştı ve en iyi boyamanın üç ayrı bileşenden elde edildiğini buldu: saf methylene blue, onun parçalanma ürünü azure B ve eosin. Bu üçü, bugün sıtma tanısında kullanılan boyanın başlıca bileşenleri olmaya devam eder; boya artık Malachowski, Wright ve Giemsa adlarını birlikte taşır.

Şekil: İnsan kırmızı hücrelerinde Plasmodium falciparum halka biçimleri, Romanowsky tipi bir yöntemle boyanmış. Halkanın içindeki mor yapı, Malachowski'nin boraksla işlem görmüş metilen mavisinin ilk kez görünür hâle getirdiği kromatindir. Görsel Ernst Hempelmann tarafından kamu malı olarak yayımlanmıştır.

Tek ad, birden fazla malzeme

Bu bileşenleri birbirinden ayıran yıllar, kimyanın kendisinden daha uzun süre kalan bir sorun bıraktı. Ralph Lillie, 1969'da biyolojik boyalar ile biyolojik olmayan boyalar arasındaki çizgiyi çekti; biyolojik boyaları "hassas ve titiz kullanımlarıyla uyumlu katı spesifikasyonlara göre üretilen", tekstil renklendirmesinde kullanılan biyolojik olmayan boyaları ise "daha az katı ve talepkâr üretim standartları gerektiren" ürünler olarak tanımladı. Her iki ürün türü de aynı adı taşıyordu ve aralarındaki fark hiçbir zaman yalnızca derece farkı olmadı. Pamuk için yazılmış bir spesifikasyon ile tanısal bir reaktif için yazılmış bir spesifikasyon birbirinin yerine kullanılamaz ve tekstil spesifikasyonuna göre üretilmiş bir malzeme yutulmak üzere tasarlanmamıştır.

Azure B bunun en açık örneğidir. Metilen mavisinin monodemetillenmiş biçimidir, kendine ait ölçülebilir farmakolojik aktivitesi vardır ve ikisi ayrıştırılmadan önce bir yüzyıldan uzun süre klinik metilen mavisi preparatlarının kontrolsüz bir bileşeni olarak bulunmuştur. Bir grup, metilen mavisi uygulamasından sonra otopside örneklenen insan dokusunun yüzde 5 ile 14 oranında değişmemiş metilen mavisi ve yüzde 86 ile 95 oranında azure B içerdiğini buldu. Belirli bir preparatın azure B içerip içermemesi ve hangi sınırda içermesi gerektiği bir spesifikasyon sorusudur ve azure B'nin safsızlık ve metabolit olarak araştırılması konuyu buradan devam ettirir.

Pratik sonuç da spesifikasyonda ortaya çıkar. USP uygunluğu, piyasanın sunduğu en yüksek saflığa giden yoldur, çünkü tek bir ölçüm değil, yayımlanmış eksiksiz bir test standardıdır. Kimliği, assay'i, azure boyaları dâhil organik safsızlıkları, residual solvents'ı, elemental impurities'i, residue on ignition'ı, microbial limits'i ve bacterial endotoxins'i kapsar. Ağır metal sonucu bildiren ve bunu USP uyumluluğu olarak adlandıran bir sertifika, bu listenin yalnızca bir satırını raporlamıştır.

Blupreme, metilen mavisini bir farmasötik üreticiden temin eder ve tam analiz sertifikasını yayımlar; yalnızca ağır metalleri değil, USP spesifikasyonunun tamamını test eder. Analiz sertifikası okuma kılavuzu ve USP tanımının neyi ortaya koyduğu ve neyi koymadığı belgenin iddiayla nasıl karşılaştırılacağını ele alır.

Tarihin neye dayanak sağladığı ve neye sağlamadığı

Soy çizgisi gerçektir ve çoğu ürün sayfasının ima ettiğinden daha uzundur. Metilen mavisi 1891'de sıtmada kullanıldı, 1899'da ajite psikozda sedatif olarak bildirildi ve yan zinciri quinacrine, chloroquine, promethazine ve chlorpromazine üzerinden uzanır. Ehrlich'in Arthur Leppmann ile birlikte 1890'da yayımladığı makale, nevraljik ve romatizmal ağrının hafiflediğini tanımladı ve ardından boyanın ruhsal hastalıklarda denenmesini değerlendirdi ancak bunu test etmemeye karar verdi.

Bunların hiçbiri modern bir kullanım ortaya koymaz. 1891 sıtma sonucu iki hasta ve bir sıcaklık grafiğinden ibaretti. Bir molekülün uzun süredir biliniyor olması, onu incelemek için bir gerekçedir; bir sonuç değildir. Bileşiğin ilaç olarak tarihi ile sıtmadaki modern çalışmalar, Ehrlich'in sorduğu sorulardan farklı soruları yanıtlar ve sonlanım noktaları kendi koşulları içinde değerlendirilmelidir.

Kayıtlarda geçmişten çok bugüne ait olan bir ayrıntı vardır. Araştırmacılar 2000'lerde Burkina Faso'da metilen mavisi sıtma çalışmaları yürüttüklerinde farmasötik dereceli malzeme için rekabet ettiklerini gördüler ve ham madde GMP doğrulaması taşıdığında fiyatının yaklaşık yüz kat arttığını bildirdiler. Bir boya ikame edilebilirdi. Bir ilaç edilemezdi. Lillie'nin 1969'da çizdiği ayrım, bugün de bir şişenin içinde ne bulunduğunu belirleyen ayrımdır. :::