Metilen mavisi ve mitokondri: elektron taşınması ve kanıtlar

Yan yana iki preparat düşünün. Her ikisinde de solunum zincirinin Kompleks I bölümünü bloke eden bir kimyasal olan rotenonla zehirlenmiş beyin mitokondrileri var. Deneyi yapan kişi, bunlardan birine pipetle mikromolar düzeyde metilen mavisi ekliyor. Oksijen kullanımı kısmen geri geliyor. Zar voltajı kısmen eski düzeyine dönüyor. Az miktarda ATP sentezi yeniden başlıyor. Yanındaki küvette ise bir peroksit sensörü hikâyenin diğer yarısını anlatıyor: test edilen her dozda ve denenen her substratta hidrojen peroksit üretimi birkaç katına çıkmış.

Her iki ölçüm de doğru. Metilen mavisi, solunum zincirinin hasarlı bir bölümünü atlayarak elektron akışını sürdürebilen bir elektron mekiğidir; aynı mekik bunu yaparken peroksit biçiminde bir bedel de ödetir. Bu iki gerçeği birlikte değerlendirdiğinizde, metilen mavisinin mitokondri işlevine ilişkin literatürü anlaşılır hâle gelir. Yalnızca birini dikkate aldığınızda ise ilk hangi makaleyi açtığınıza bağlı olarak bir mucize ya da tehdit gibi görünür.

Mekik mekanizmasının sade açıklaması

Solunum zinciri bir aktarım hattıdır. Elektronlar Kompleks I üzerinden (NADH'den) ya da Kompleks II ve ilgili flavin enzimleri üzerinden (süksinat ve benzer vericilerden) zincire girer; Kompleks III'ten geçerek hareketli taşıyıcı sitokrom c'ye, ardından Kompleks IV üzerinden oksijene ulaşır. Her aktarım, iç zarın bir tarafından diğerine proton pompalar ve oluşan gradyan ATP sentezini sağlar. Herhangi bir istasyonu bloke ettiğinizde, hattın bu istasyondan önceki bölümü sessizleşir.

Metilen mavisi, paralel bir kurye olarak devreye girer. Oksitlenmiş biçimi, zincirin önceki bölümlerindeki taşıyıcılardan elektron alarak renksiz, indirgenmiş biçim olan lökometilen mavisine dönüşür; ardından bu elektronları zincirin sonraki bölümlerine aktarır ve yeniden maviye döner. Bu iki biçim redoks çiftinin açıklamasında ele alınır; daha geniş kapsamlı aktarım davranışı ise genel mekanizma açıklamasının konusudur. Açık kalan soru, kuryenin hatta nereden yeniden katıldığıdır: Kompleks III'ün Qo bölgesi olarak bilinen kinol bağlanma cebinden mi, yoksa doğrudan sitokrom c'den mi? Hangi çıkışın baskın olduğu koşullara bağlıdır; Kompleks III'ü atlama analizinde bu durum ayrıntılı olarak açıklanır.

Üç kemirgen çalışması gerçekte neyi ölçtü?

Üç çalışmanın tamamında izole beyin mitokondrileri kullanıldı; yani organeller hücreden çıkarılıp bileşimi tanımlanmış bir tampon çözeltide süspanse edildi. Bütünlüğü korunmuş hücreler, madde uygulanmış hayvanlar veya insan katılımcılar yoktu. Konsantrasyonlar, bir insana ağızdan verilen dozu değil, organelleri çevreleyen ortamı ifade eder. Bu çerçeveyi koruduğunuzda sayılar açıkça konuşur.

İlk çalışma, 100 nanomolar ile 2 mikromolar arasındaki konsantrasyonlarda izole kobay beyin mitokondrileriyle yapıldı ve aynı preparatta hem yararı hem de bedeli ortaya koydu. Sağlıklı mitokondrilerde boya, dinlenim hâlindeki oksijen kullanımını artırdı ancak ADP ile uyarılan solunumu değiştirmedi; dolayısıyla solunuma eşlenmiş ATP üretimi iyileşmedi. Kompleks I blokajı altında, 2 mikromolar konsantrasyon ATP sentezini miligram başına dakikada 46 nanomolden 93 nanomole çıkardı; normal hız yaklaşık 1109 idi. Kompleks III blokajı altında aynı konsantrasyon, ATP üretimini yaklaşık 46'dan 63'e çıkardı; normal hız yaklaşık 910 idi. Voltaj ve kalsiyum alımı kısmen geri geldi. Kompleks IV'ün siyanürle bloke edilmesi aşılamadı; bu da işlevsel elektron çıkışının, çalışan bir Kompleks IV'ten önce yer aldığını gösterir. İşlevdeki her geri kazanım istatistiksel olarak gerçekti ama küçüktü: normal ATP üretiminin tek haneli yüzdeleri düzeyindeydi.

İkinci çalışma, yaklaşık 1 mikromolar konsantrasyonda fare korteks mitokondrileriyle yapıldı; Kompleks I'in atlanabildiğini doğruladı ve Kompleks III'te bir sınır çizdi. Rotenon, solunumu miligram başına dakikada yaklaşık 121 nanomol oksijenden 2'nin altına düşürdü; boya ise bunu yaklaşık 21'e, normalin kabaca altıda birine çıkardı. Bu sırada zar voltajı neredeyse tamamen geri geldi. Ancak Kompleks III blokajından sonra, 1 ile 5 mikromolar aralığında ne solunum ne de voltaj geri geldi; ayrıca blokaj, boyanın oluşturduğu peroksit sinyalini baskıladı. Yazarlar, indirgenmiş boyanın elektronlarını Kompleks III'ün Qo bölgesine aktardığını öne sürdü: bu bölge dolu olduğunda kuryenin teslimat yapabileceği bir yer kalmıyordu.

Üçüncü çalışma, çoğunlukla 2 mikromolar konsantrasyonda fare, sıçan ve kobay beyin mitokondrileriyle yapıldı; görüş ayrılığını doğrudan test etti ve Kompleks III blokajının aşılabildiğini buldu. Qo bölgesi inhibitörü miksotiyazol bazal solunumu yüzde 88 azalttığında, boya oksijen kullanımını blokaj uygulanmamış hızın yaklaşık yüzde 62'sine geri getirdi. Doğrudan yapılan bir testte, yarım mikromolar konsantrasyon, Kompleks III bloke edilmişken bile dışarıdan eklenen sitokrom c'yi indirgedi; bu da NADH'den boya aracılığıyla sitokrom c'ye ve oradan Kompleks IV'e uzanan bir yolu destekledi. Ancak geri kazanılan solunum anormal davranıyordu: eklenen ADP, oksijen kullanımını artırmak yerine düşürüyor, ATP sentezinin bloke edilmesi ise solunumu uyarıyordu. Zar voltajı yalnızca kısmen geri geldi. Eşlenmenin tersine döndüğü yüksek oksijen kullanımı, normal enerji üretimi değildir.

Laboratuvarlar neden farklı sonuçlara ulaşıyor ve bunu ne açıklıyor?

Önce, farkı türlere bağlayan açıklama geçerliliğini yitiriyor. Üçüncü grup, çalışmayı üç kemirgen türünde tekrarladı ve atlama yolunun bulunmadığı bildirilmiş olan fare suşu dâhil, hepsinde niteliksel olarak aynı atlama davranışını elde etti. Farklı olanlar konsantrasyon (1 ve 2 mikromolar), inhibitör dozları, tampon çözeltiler, izolasyon yöntemleri ve her şeyden önce karşılaştırılan enerji durumuydu: atlama davranışı, paradoksal ADP yanıtının da görüldüğü ADP eklenmesi öncesinde en belirgindi. Bu nedenle bulguları dürüstçe yansıtan bir diyagram, koşullara bağlı iki çıkış gösterir: biri Qo bölgesinde, diğeri sitokrom c'de. Kurye, yerel kimyanın izin verdiği noktada teslimat yapar.

Peroksit bedeli

Bedel tarafı, işlevin geri kazanılması tarafı kadar tutarlıdır. Kobay çalışmasında boya, üç substratın tamamında ve test edilen her koşulda —dinlenim hâlinde, ATP sentezi sırasında ve kimyasal olarak işlev bozulduğunda— peroksit salımını artırdı. ATP sentezi sırasında, 1 mikromolar konsantrasyonda üretim miligram başına dakikada yaklaşık 148 pikomolden 1500'ün üzerine çıktı; 100 nanomolar konsantrasyon bile sinyali dört katından fazla artırdı. Boya ayrıca peroksitin uzaklaştırılmasını yaklaşık 2.6 kat yavaşlattı; dolayısıyla sinyal, daha hızlı oluşum ile daha yavaş temizlenmenin birleşimini yansıtıyor. Önerilen kimyasal açıklama, tespit edilebilir süperoksit oluşmadan oksijenin indirgenmiş boya tarafından doğrudan indirgenmesidir; ancak bu, kanıtlanmış bir basamak değil, hâlâ bir yorumdur.

Fare çalışması tabloyu yararlı biçimde daha karmaşık hâle getiriyor. Peroksit, dozla birlikte hızla arttı; 2 mikromolar konsantrasyonda miligram başına dakikada yaklaşık 76 pikomollük başlangıç düzeyinden yaklaşık 2000'e çıktı. Buna karşın Kompleks III blokajı, boyadan kaynaklanan bileşeni baskıladı. Peroksit yalnızca indirgenmiş boyanın oksijenle tepkimesinden kaynaklansaydı, zinciri bloke etmek bu kadar büyük bir fark yaratmamalıydı. Ama yaratıyor; dolayısıyla zincir de sürece katılıyor. Antioksidan ve prooksidan incelemesi bu ikiliği daha geniş bir bağlama yerleştirirken, oksijen ile ATP karşılaştırması yalnızca oksijen verilerinin neden bir enerji iddiasını hiçbir zaman kesinleştiremeyeceğini açıklıyor.

İşlevin geri kazanılması onarım değildir

Artık kullanılmaması gereken ifade, “metilen mavisi mitokondrileri onarır mı?” sorusudur. Onarım, kalıcı bir düzeltme anlamına gelirdi: yeniden oluşturulmuş kompleksler, madde uzaklaştıktan sonra da süren eşlenme, bütünlüğü korunmuş hücrelerde toparlanma ve ardından canlı bir organizmada iyileşen işlev. Üç makalenin hiçbiri bunu göstermiyor. Gösterdikleri şey, yeni izole edilmiş organellerde yapay kimyasal blokaj sırasında elektronların anlık olarak başka bir yola yönlendirilmesidir; ATP üretimi normalin küçük bir bölümü düzeyinde kalır ve eşlenme bazen açıkça tuhaftır. Rotenon ve antimisin laboratuvar araçlarıdır; yaşlanmanın veya insan mitokondri hastalıklarının modelleri değildir. Buradaki hiçbir bulgu, sağlıklı bir kişi için daha fazla enerji anlamına gelmez; bu, kendi insan çalışmalarına sahip ayrı bir kanıt sorusudur.

Biohacking konusunda varılacak herhangi bir sonucun dürüst kalmasını üç sınır sağlar. Birincisi, ortam konsantrasyonu doz değildir: izole organellerin çevresindeki 0.1 ile 2 mikromolar aralığı, ağızdan alınan hangi miktarın insan beynindeki bir mitokondride bu serbest konsantrasyonu oluşturacağını söylemez; özellikle de boyanın birikmesi veya salınması doğrudan zar voltajına bağlıyken. İkincisi, oksijen enerji değildir: boya, verimli fosforilasyonun yanı sıra döngüsel tepkimeler ve elektron kaçağı yoluyla da oksijen kullanımını artırabilir. Bu nedenle ATP ve voltaj ölçümleri olmadan yapılan respirometri, bir enerji iddiasını gerekçelendiremez. Üçüncüsü, yarar ve yük aynı cümlede yer almalıdır: geri kazanılan voltaj veya ATP hakkında, eşzamanlı peroksit artışını dışarıda bırakan herhangi bir ifade deneyi yanlış aktarır. İlgili diğer sınırlayıcı unsurlar NAD redoks dengesi, doz-yanıt eğrisinin biçimi ve ölçüm yöntemi kılavuzunda ele alınır.

Pratik bir dipnot: mekik davranışı, tam olarak bu molekülün bir özelliğidir. Azure B gibi demetillenmiş türevler de redoks açısından aktiftir ancak farklı davranırlar; bu nedenle kısmen bozunmuş bir çözeltiyle yapılan deney, bozulmamış boyayla yapılan deneyden farklıdır. Yalnızca metal taraması yerine tam farmakope spesifikasyonunu ve yayımlanmış bir parti belgesini talep etmenin nedenlerinden biri budur. Işıkla yönlendirilen kimya da aydınlatılan uygulamalar için benzer bir uyarı getirir; bu konu kırmızı ışık kombinasyonlarında ele alınır.

Dar kapsamlı iddia, tüm bunlara rağmen geçerliliğini korur ve korunmaya değerdir: metilen mavisi, hasarlı izole mitokondrilerde koşullara bağlı bir elektron kuryesi olarak işlev görebilir ve peroksit bedeli karşılığında akışı kısmen sürdürebilir. Bunun ötesindeki her şey —enerji, uzun ömür, onarım— bu çalışmaların sağlamak üzere tasarlanmadığı kanıtları bekliyor.