Eksperimenti koji su povezali metilensko plavo sa ćelijskim disanjem

Defibrinisana ljudska krv, zagrevana na 37 °C tokom tri sata, potroši oko dva procenta kiseonika koji sadrži. Ako se pre inkubacije doda mala količina metilenskog plavog, ista krv potroši oko šezdeset pet procenata. U ćelijama se ništa nije promenilo. Promenio se samo rastvor.

Taj podatak potiče iz rada koji su 1928. objavili George Harrop i E. S. Guzman Barron sa univerziteta Johns Hopkins i predstavlja izvor često ponavljane tvrdnje da metilensko plavo poboljšava ćelijsko disanje. Tvrdnja nije netačna, ali je njeno značenje uže nego što zvuči.

Šta broj u tabeli zapravo meri

Merena veličina bila je unos kiseonika, određen analizom gasova. Harrop i Barron su sveže uzetu krv filtrirali kroz vatu na 10 °C da bi uklonili leukocite, zasitili uzorak kiseonikom, podelili ga, dodali boju jednom delu i analizirali oba dela posle inkubacije. Broj leukocita retko je prelazio oko hiljadu po kubnom milimetru. Potrošnja kiseonika prikazana je kao udeo početnog sadržaja kiseonika u uzorku koji je nestao.

Merili su i ugljen-dioksid, ali je tu sama metoda stvarala teškoće. Defibrinisana krv je tokom prvog sata inkubacije oslobađala do dva milimola ugljen-dioksida na 100 mL iz razloga koji nisu bili povezani sa ispitivanom reakcijom, pa su respiratorni količnici dobijeni iz pune krvi bili neupotrebljivi. Samo su isprane ćelije u Lockeovom rastvoru davale vrednosti koje su se mogle tumačiti, a one su se kretale između 0.73 i 0.80, i sa bojom i bez nje.

Taj detalj nije nevažan. „Disanje“ u ovim radovima znači razmenu gasova u zatvorenoj posudi. Razlika između potrošnje kiseonika i stvaranja upotrebljive energije razmatra se zasebno u tekstu šta potrošnja kiseonika govori, a šta ne govori o ATP-u.

Boja je najviše povećavala potrošnju tamo gde su ćelije najmanje disale

Zreli eritrociti sisara gotovo da nemaju merljivu potrošnju kiseonika. Eritrociti ptica sa jedrom imaju. Harrop i Barron ispitivali su i jedne i druge, a ta razlika je okosnica njihovog argumenta.

U uzorcima sisara boja je izazvala povećanja od dvadeset do pedeset puta. U krvi guske, čije su ćelije već disale, nikada nije povećala brzinu više od dva puta. Što je početno disanje bilo intenzivnije, to je boja mogla manje da ga poveća.

Isti odnos vidi se i unutar jedne vrste. Uzorak ljudske krvi pacijenta sa policitemijom verom, koji je sadržao nezrele ćelije, potrošio je 11.3 procenta svog kiseonika bez prisustva boje, naspram 2.8 procenata kod ispranih ćelija zdravog davaoca. Boja je tu vrednost podigla samo na 63.4 procenta, što je šestostruko ubrzanje, dok su se normalne ćelije ubrzale gotovo trideset puta. Boja je približila ponašanje zrelih ćelija ponašanju nezrelih, upravo onako kako su autori opisali njeno delovanje.

Cijanid je trebalo da to zaustavi

Bilo je poznato da cijanid zaustavlja ćelijsku oksidaciju. Harrop i Barron su ga ipak dodali, zajedno sa bojom.

Rezultati dobijeni na goveđoj krvi su reprezentativni. Sadržaj kiseonika je tokom tri sata bez ikakvih dodataka pao sa 22.61 na 22.03 zapreminska procenta. Sa metilenskim plavim pao je na 12.84. Sa metilenskim plavim i kalijum-cijanidom u koncentraciji od jednog petohiljaditog dela mola po litru pao je na 12.74. Efekat boje ostao je praktično nepromenjen.

Slika: kontinuirani zapis mikrorespiracije ljudskih eritrocita. Strelica označava dodavanje metilenskog plavog. Pre toga kriva je gotovo ravna; posle toga neprekidno raste. Preuzeto iz rada Harropa i Barrona, Journal of Experimental Medicine 48:207–223 (1928), PMID 19869478.

Zaključili su da boja deluje kao prenosilac kiseonika, „obezbeđujući supstancu koja je nestala iz zrelih eritrocita sisara bez jedra“. Dve godine kasnije, Michaelis i Salomon sa instituta Rockefeller dali su tom neslaganju oblik koji se zadržao. Efekat boje bio je ili „slučajno svojstvo boje“ ili je boja bila „model za neku nepoznatu supstancu u organizmima“. Između te dve mogućnosti još nije konačno presuđeno. Promenilo se to što se ćelije danas mogu opisati mnogo preciznije.

Ekstrakt jetre imao je isti efekat

Michaelis i Salomon pokazali su da ekstrakti organa dobijeni hladnom vodom izazivaju istu stimulaciju. Jetra pacova imala je najjači efekat, a sledili su bubreg, slezina i testis. Mozak, mišić i krvni serum imali su mali efekat ili ga uopšte nisu imali.

Zatim su ispitali ekstrakt u prisustvu ugljen-monoksida. Disanje izazvano bilo ekstraktom bilo bojom ostalo je nepromenjeno u smeši od 98 procenata ugljen-monoksida i 2 procenta kiseonika. Ista smeša gasova inhibirala je disanje kvasca i eritrocita živine sa jedrom za približno 60 do 80 procenata, u skladu sa Warburgovim opisom respiratornog fermenta osetljivog na ugljen-monoksid. Neidentifikovana supstanca iz tkiva, dakle, nije bila Warburgov enzim.

Tokom istraživanja odbačeno je nekoliko mogućih identiteta te supstance. Redukovani glutation i cistein izazivali su samo onu potrošnju kiseonika koja je bila potrebna za njihovu sopstvenu oksidaciju. Koenzim Hardena i Younga isključen je zato što ga mišić sadrži najviše, a pokazao je gotovo najmanji efekat. Keilinov citohrom, nazvan nekoliko godina ranije, naišao je na istu protivrečnost. Sopstvenu pretpostavku da aktivna supstanca potiče iz ćelijskog jedra nazvali su pukom pretpostavkom.

Efekat je zavisio od određenih uslova

Ćelije su morale da budu neoštećene. Hemoliza izazvana destilovanom vodom ili ponovljenim zamrzavanjem ukidala je odgovor i na boju i na ekstrakt, a delimična hemoliza ga je srazmerno smanjivala.

Bio je potreban i šećer. Glukoza, fruktoza i saharoza podržavale su disanje izazvano bojom; manitol nije. Bez prisustva šećera nije bilo nikakvog disanja, a izgledalo je da boja pritom oštećuje ćelije, pa glukoza dodata jedan ili dva sata kasnije nije mogla da ga obnovi. Autori su pretpostavili da boja oksiduje neku strukturnu komponentu potrebnu ćeliji.

Osvetljenje je znatno povećavalo efekat boje, mada je efekat bio jasno uočljiv i u mraku. Druge boje koje se mogu redukovati ponašale su se drugačije: toluilensko plavo imalo je isti ili jači efekat od metilenskog plavog, dok indigo-disulfonat nije imao gotovo nikakav efekat. Nije utvrđena jasna veza između oksidaciono-redukcionog potencijala boje i veličine njenog efekta, što su autori pripisali propustljivosti membrane i toksičnosti.

Efekat je pratio fermentaciju, a ne disanje

Barronovo istraživanje iz 1930. prešlo je sa ćelijskih suspenzija na preseke tkiva normalnih organa pacova i transplantiranih tumora.

U tkivima bez aerobne glikolize, metilensko plavo nije imalo efekta ili je blago smanjivalo potrošnju kiseonika: u bubregu za oko 14 procenata, u pankreasu za oko 14 procenata, u jetri za oko 5 procenata. U tkivima koja fermentišu u prisustvu kiseonika povećavalo je potrošnju: u slezini za oko 8 procenata, u mozgu za oko 13 procenata. Povećanja u tumorima kretala su se od oko 27 procenata u ljudskom karcinomu dojke do više od 80 procenata u Rousovom sarkomu kokoške, približno srazmerno aerobnoj glikolizi svakog tkiva.

Slika: svaka tačka predstavlja jedan tip tkiva. Horizontalna osa prikazuje aerobnu glikolizu; vertikalna osa prikazuje promenu potrošnje kiseonika nakon dodavanja metilenskog plavog. Podaci iz rada Barrona, Journal of Experimental Medicine 52:447–456 (1930), tabela 6, PMID 19869777.

Eksperiment sa cijanidom zatim je dao obrnutu sliku. Kada je disanje u tim prethodno neosetljivim tkivima blokirano cijanidom i fermentacija došla do izražaja, boja je ponovo povećavala potrošnju kiseonika: u bubregu za oko 59 procenata, u jetri za oko 19 procenata, u slezini za oko 286 procenata, u testisu za oko 200 procenata.

Barron je predložio da boja može poslužiti kao test fermentativnog kapaciteta ćelije ili tkiva i završio nagađanjem: višegeneracijsko uzgajanje tumora u podlozi koja sadrži boju možda bi jednog dana moglo trajno da učini metabolizam tumora sličnim metabolizmu normalnog tkiva. To je bilo istraživačko pitanje napisano 1930. Nije tvrdnja o lečenju.

Šta eksperimenti nisu mogli da mere

Godine 1928. i 1930. „disanje“ je značilo potrošnju kiseonika. Adenozin-trifosfat prvi put je opisan 1929, a dokaz da izolovane mitohondrije esterifikuju fosfat dok prenose elektrone došao je 1949. Nijedan od ranih radova o metilenskom plavom nije mogao da meri proizvodnju energije i nijedan nije tvrdio da je meri.

Ćelije su drugi problem. Zreli eritrociti sisara ne sadrže mitohondrije. Tokom stadijuma retikulocita uklanjaju mitohondrije i ribozome selektivnom autofagijom, zbog čega zreli eritrocit dobija energiju glikolizom, a od svog pentozo-fosfatnog puta zavisi uglavnom radi dobijanja NADPH, a ne ATP-a. U eksperimentima iz 1928. nije postojao lanac transporta elektrona koji bi se mogao popraviti. Šta god da je trošilo kiseonik, radilo je nešto drugo.

Šta je to drugo bilo danas je prilično dobro opisano. Metilensko plavo prihvata elektrone iz ćelijskih redukcionih ekvivalenata i prelazi u leukometilensko plavo, koje molekularni kiseonik ponovo oksiduje, zatvarajući ciklus. U ljudskim eritrocitima korak redukcije obavljaju flavin-reduktaza zavisna od NADPH i srodne disulfid-reduktaze. Istraživanje iz 1976. u kojem je korišćena obeležena glukoza pokazalo je da boja stimuliše heksozo-monofosfatni put, da je efekat pri niskoj koncentraciji zavisio od oksihemoglobina i da je viša koncentracija, 0.1 mM, stvarala vodonik-peroksid. Redukovana boja u kontaktu sa kiseonikom stvara peroksid, a ne fosfatne veze.

U mitohondrijama je slika spornija nego što popularni sažeci priznaju. Jedan pravac istraživanja smatra da boja preuzima elektrone iz područja kompleksa I i predaje ih citohromu c. Drugi je utvrdio da u mitohondrijama mozga miša ne može da obnovi disanje nakon blokade antimicinom i umesto toga smestio prihvatač elektrona na mesto vezivanja ubihinola u kompleksu III. Treći je utvrdio da niske koncentracije povećavaju potrošnju kiseonika u mirovanju, dok disanje stimulisano ADP-om ostaje nepromenjeno. Najdirektniji iskaz suštine jeste da potrošnja kiseonika izazvana metilenskim plavim uopšte ne zavisi od oksidativne fosforilacije: opstajala je kada je respiratorni lanac bio inhibiran, kao i u preparatima koji ga nisu imali.

Postoje i direktna merenja raskoraka između te dve veličine. U izolovanim mitohondrijama jetre pacova, povećavanje koncentracije boje smanjivalo je odnose respiratorne kontrole i izazivalo bubrenje, što su autori opisali kao razdvajanje oksidativne fosforilacije. U perfundovanoj jetri pacova, metilensko plavo povećavalo je potrošnju kiseonika dok je odnos ATP-a prema ADP-u opadao.

Klinički podaci nose istu poruku. Methemoglobinemija se leči intravenskom primenom približno jednog do dva miligrama metilenskog plavog po kilogramu, putem redukcionog puta zavisnog od NADPH, a veće doze izazivaju stanje koje se leči. Isti pregled navodi da je antidotski efekat najveći u neoštećenim eritrocitima i oslabljen kada je prisutna hemoliza, što je nalaz o hemolizi iz 1930. koji se ponovo javlja sedamdeset tri godine kasnije u bolničkom kontekstu. Jedinjenje čiji se korisni i štetni efekti nalaze sa suprotnih strana određenog doznog praga nije jedinjenje čiju bi dozu trebalo zaključivati iz merenja potrošnje kiseonika.

Zašto i serija proizvoda pripada ovoj raspravi

Harrop i Barron primetili su nešto što vredi ponovo pročitati. Samo metilensko plavo daje traku u spektroskopu između dve karakteristične trake methemoglobina, „što pri površnom pregledu lako može izazvati zabunu“. Boja može da oponaša supstancu koja se traži.

Isti problem ima i hemijski oblik. Srodni fenotiazin prisutan kao sporedni sastojak ima sopstveno redoks ponašanje, sopstvenu propustljivost i sopstvenu toksičnost. Jedan dokumentovani slučaj jasno pokazuje zašto je to važno: u istraživanju jodovanja metilenskog plavog, uzorci koji su sadržali približno 7 do 8 procenata Azure B davali su uglavnom jodovani Azure B, pa je u reakciji dominirala nečistoća, a ne metilensko plavo.

Svako ko koristi metilensko plavo kao reagens, u laboratoriji, na radnom mestu za bojenje preparata ili u akvarijumu, radi sa sastojkom nedefinisanog sastava ako serija nije karakterisana. Srodne supstance, identitet, elementarne nečistoće, rezidualni rastvarači i ostatak nakon žarenja deo su eksperimenta, a ne samo prateća dokumentacija. Blupreme nabavlja svoje metilensko plavo od farmaceutskog proizvođača i objavljuje kompletan sertifikat analize, uz ispitivanje cele USP specifikacije, a ne samo teških metala; vodič za čitanje sertifikata analize i tekst šta oznaka kvaliteta prema USP-u potvrđuje, a šta ne objašnjavaju kako proveriti da li dokument potkrepljuje tvrdnju.

Broj je bio tačan

Eksperimenti iz 1928. i 1930. sprovedeni su pažljivo, a njihovo glavno zapažanje ostalo je potvrđeno: boja koja se može redukovati može navesti ćeliju koja jedva diše da troši kiseonik višestruko brže nego u mirovanju, bez prolaska kroz korak koji cijanid blokira.

Greška se javlja kasnije, kada se „disanje“ tumači u savremenom značenju. Merenje razmene gasova govori da su elektroni stigli do kiseonika. Ne govori da je ijedan od njih iskorišćen za stvaranje ATP-a, a u ćeliji bez mitohondrija jaz između te dve tvrdnje ne može biti veći. Šira mapa delovanja metilenskog plavog u ćelijama smešta istu razliku u širi okvir, a istorija jedinjenja od boje do leka objašnjava kako je boja za tekstil uopšte dospela do ovih eksperimenata.