Eksperimentet që lidhën blunë e metilenit me frymëmarrjen qelizore

Gjaku njerëzor i defibrinuar, i mbajtur në 37 °C për tre orë, konsumon rreth dy për qind të oksigjenit që përmban. Shtoni një sasi të vogël blu metileni para inkubimit, dhe i njëjti gjak konsumon rreth gjashtëdhjetë e pesë për qind. Asgjë te qelizat nuk ndryshoi. Ndryshoi vetëm tretësira.

Kjo shifër vjen nga një punim i vitit 1928 nga George Harrop dhe E. S. Guzman Barron në Johns Hopkins, dhe është zanafilla e pohimit të përsëritur gjerësisht se bluja e metilenit përmirëson frymëmarrjen qelizore. Pohimi nuk është i rremë, por ka kuptim më të ngushtë nga sa duket.

Çfarë mat në të vërtetë shifra në tabelë

Treguesi përfundimtar ishte marrja e oksigjenit, e përcaktuar përmes analizës së gazeve. Harrop dhe Barron filtruan gjakun e sapomarrë përmes pambukut në 10 °C për të hequr rruazat e bardha, e ngopën mostrën me oksigjen, e ndanë, shtuan ngjyrues në njërën pjesë dhe i analizuan të dyja pas inkubimit. Numri i leukociteve rrallë tejkalonte rreth një mijë për milimetër kub. Konsumi i oksigjenit raportohej si pjesa e përmbajtjes fillestare të oksigjenit të mostrës që ishte zhdukur.

Ata matën edhe dioksidin e karbonit, por aty metoda paraqiti vështirësi. Gjaku i defibrinuar çlironte deri në dy milimole dioksid karboni për 100 mL gjatë orës së parë të inkubimit, për arsye që nuk lidheshin me reaksionin në studim, ndaj koeficientët respiratorë të gjakut të plotë ishin të papërdorshëm. Vetëm qelizat e lara në tretësirën e Locke dhanë vlera të interpretueshme, të cilat grumbulloheshin midis 0.73 dhe 0.80, si me ngjyruesin, ashtu edhe pa të.

Ky detaj nuk është i parëndësishëm. Në këto punime, «frymëmarrje» do të thotë shkëmbim gazesh brenda një ene të mbyllur. Hendeku midis konsumit të oksigjenit dhe prodhimit të energjisë së dobishme shqyrtohet veçmas te çfarë ju tregon dhe çfarë nuk ju tregon konsumi i oksigjenit për ATP-në.

Ngjyruesi dha shtesën më të madhe aty ku qelizat kryenin më pak frymëmarrje

Eritrocitet e pjekura të gjitarëve pothuajse nuk kanë konsum të matshëm të oksigjenit. Eritrocitet me bërthamë të shpendëve kanë. Harrop dhe Barron i testuan të dyja, dhe ky kontrast është baza e argumentit të tyre.

Në mostrat e gjitarëve, ngjyruesi shkaktoi rritje njëzet deri në pesëdhjetë herë. Në gjakun e patës, qelizat e të cilit tashmë kryenin frymëmarrje, ai nuk e rriti kurrë shpejtësinë më shumë se dyfish. Sa më e lartë të ishte frymëmarrja fillestare, aq më pak mund të shtonte ngjyruesi.

I njëjti gradient shfaqet brenda një specieje. Një mostër njerëzore nga një pacient me policitemi vera, që përmbante qeliza të papjekura, konsumoi 11.3 për qind të oksigjenit të saj pa ngjyrues, kundrejt 2.8 për qind për qelizat e lara nga një dhurues i shëndetshëm. Ngjyruesi e çoi vetëm në 63.4 për qind, një përshpejtim gjashtëfish, ndërsa qelizat normale u përshpejtuan pothuajse tridhjetëfish. Ngjyruesi i shtyu qelizat e pjekura drejt sjelljes së atyre të papjekura, pikërisht siç thanë autorët.

Cianuri duhej ta kishte ndalur

Dihej se cianuri ndalte oksidimin qelizor. Harrop dhe Barron e shtuan gjithsesi, bashkë me ngjyruesin.

Rezultatet e gjakut të gjedhit janë përfaqësuese. Përmbajtja e oksigjenit ra nga 22.61 në 22.03 vëllime për qind gjatë tre orëve pa asnjë shtesë. Me blu metileni, ajo ra në 12.84. Me blu metileni dhe cianur kaliumi në përqendrim molar prej një të pesëmijtës, ajo ra në 12.74. Efekti i ngjyruesit mbeti në thelb i paprekur.

Figura: një regjistrim i vazhdueshëm i mikrofrymëmarrjes së eritrociteve njerëzore. Shigjeta shënon shtimin e blusë së metilenit. Para saj, vija është pothuajse e sheshtë; më pas ngjitet në mënyrë të qëndrueshme. Riprodhuar nga Harrop dhe Barron, Journal of Experimental Medicine 48:207–223 (1928), PMID 19869478.

Përfundimi i tyre ishte se ngjyruesi vepronte si bartës oksigjeni, «duke furnizuar një substancë që është zhdukur nga eritrocitet pa bërthamë të gjitarëve të rritur». Dy vjet më vonë, Michaelis dhe Salomon në Institutin Rockefeller i dhanë mospajtimit formën e tij përfundimtare. Ose efekti i ngjyruesit ishte «një veti rastësore e ngjyruesit», ose ngjyruesi ishte «një model për ndonjë substancë të panjohur në organizma». Kjo dilemë nuk është zgjidhur. Ajo që ka ndryshuar është se qelizat tani mund të përshkruhen shumë më saktë.

Një ekstrakt mëlçie bëri të njëjtën gjë

Michaelis dhe Salomon treguan se ekstraktet e organeve të përftuara me ujë të ftohtë prodhojnë të njëjtin stimulim. Mëlçia e miut të laboratorit kishte efektin më të fortë, e ndjekur nga veshka, shpretka dhe testikuli. Truri, muskuli dhe serumi i gjakut kishin pak ose aspak efekt.

Më pas ata e testuan ekstraktin kundrejt monoksidit të karbonit. Frymëmarrja e nxitur qoftë nga ekstrakti, qoftë nga ngjyruesi, mbeti e pandryshuar në një përzierje prej 98 për qind monoksid karboni dhe 2 për qind oksigjen. E njëjta përzierje gazesh frenonte frymëmarrjen e majasë dhe atë të eritrociteve me bërthamë të shpendëve me rreth 60 deri në 80 për qind, në përputhje me përshkrimin e Warburg për një ferment respirator të ndjeshëm ndaj monoksidit të karbonit. Pra, substanca e paidentifikuar e indit nuk ishte enzima e Warburg.

Gjatë kërkimit u përjashtuan disa identitete të mundshme. Glutationi i reduktuar dhe cisteina prodhuan vetëm konsumin e oksigjenit të nevojshëm për oksidimin e tyre. Koenzima e Harden dhe Young u përjashtua sepse muskuli përmban sasinë më të madhe të saj dhe tregoi pothuajse efektin më të vogël. Citokromi i Keilin, i emërtuar disa vjet më herët, hasi në të njëjtën kundërthënie. Sugjerimin e tyre se substanca aktive vinte nga bërthama qelizore, ata e quajtën thjesht një sugjerim.

Efekti varej nga disa kushte

Qelizat duhej të ishin të paprekura. Hemoliza nga uji i distiluar ose ngrirja e përsëritur e zhdukte përgjigjen si ndaj ngjyruesit, ashtu edhe ndaj ekstraktit, ndërsa hemoliza e pjesshme e zvogëlonte atë në përpjesëtim.

Nevojitej edhe sheqer. Glukoza, fruktoza dhe saharoza mbështetnin frymëmarrjen e nxitur nga ngjyruesi; manitoli jo. Pa sheqer nuk kishte fare frymëmarrje, dhe gjatë këtij procesi ngjyruesi dukej se i dëmtonte qelizat, ndaj glukoza e shtuar një ose dy orë më vonë nuk e rikthente atë. Autorët sugjeruan se ngjyruesi po oksidonte një përbërës strukturor që i nevojitej qelizës.

Ndriçimi e rriste ndjeshëm efektin e ngjyruesit, megjithëse efekti ishte i qartë edhe në errësirë. Ngjyrues të tjerë të reduktueshëm silleshin ndryshe: bluja e toluilenit e barazonte ose e tejkalonte blunë e metilenit, ndërsa disulfonati i indigos nuk bënte pothuajse asgjë. Nuk u shfaq ndonjë lidhje e qartë midis potencialit të oksido-reduktimit të një ngjyruesi dhe madhësisë së efektit të tij, gjë që autorët ia atribuuan përshkueshmërisë së membranës dhe toksicitetit.

Efekti ndiqte fermentimin, jo frymëmarrjen

Studimi i Barron i vitit 1930 kaloi nga suspensionet qelizore te prerjet e indeve të organeve normale të minjve të laboratorit dhe të tumoreve të transplantuara.

Në indet pa glikolizë aerobe, bluja e metilenit nuk bënte asgjë ose e frenonte lehtë konsumin e oksigjenit: në veshkë me rreth 14 për qind, në pankreas me rreth 14 për qind, në mëlçi me rreth 5 për qind. Në indet që fermentojnë në prani të oksigjenit, ajo e rriste konsumin: në shpretkë me rreth 8 për qind, në tru me rreth 13 për qind. Rritjet në tumore shkonin nga rreth 27 për qind në një karcinomë të gjirit njerëzor deri në më shumë se 80 për qind në një sarkomë Rous të pulës, afërsisht në përpjesëtim me glikolizën aerobe të secilit ind.

Figura: çdo pikë përfaqëson një lloj indi. Boshti horizontal është glikoliza aerobe; boshti vertikal është ndryshimi i konsumit të oksigjenit pas blusë së metilenit. Të dhëna nga Barron, Journal of Experimental Medicine 52:447–456 (1930), Tabela 6, PMID 19869777.

Eksperimenti me cianur më pas prodhoi pamjen e kundërt. Kur frymëmarrja në ato inde që më parë nuk përgjigjeshin u bllokua me cianur dhe fermentimi u bë i dukshëm, ngjyruesi e rriti sërish konsumin e oksigjenit: në veshkë me rreth 59 për qind, në mëlçi me rreth 19 për qind, në shpretkë me rreth 286 për qind, në testikul me rreth 200 për qind.

Barron propozoi se ngjyruesi mund të shërbente si test për kapacitetin fermentues të një qelize ose indi dhe e mbylli me një hamendësim: breza të kulturave tumorale në një mjedis që përmban ngjyrues mund ta bënin një ditë metabolizmin e një tumori përgjithmonë të ngjashëm me atë të indit normal. Kjo ishte një pyetje kërkimore e shkruar në vitin 1930. Nuk është një pretendim për trajtim.

Çfarë nuk mund të kishin matur eksperimentet

Në vitet 1928 dhe 1930, «frymëmarrje» nënkuptonte konsumin e oksigjenit. Trifosfati i adenozinës u raportua për herë të parë në vitin 1929, ndërsa demonstrimi se mitokondritë e izoluara esterifikojnë fosfatin gjatë transferimit të elektroneve erdhi në vitin 1949. Asnjë nga punimet e hershme për blunë e metilenit nuk mund të kishte matur prodhimin e energjisë, dhe asnjëri nuk pretendoi se e kishte bërë.

Qelizat janë problemi i dytë. Eritrocitet e pjekura të gjitarëve nuk përmbajnë mitokondri. Gjatë fazës së retikulocitit, ato largojnë mitokondritë dhe ribozomet përmes autofagjisë selektive, prandaj një rruazë e kuqe e pjekur funksionon me glikolizë dhe varet nga rruga e pentozë-fosfatit kryesisht për NADPH, jo për ATP. Në eksperimentet e vitit 1928 nuk ishte e pranishme ndonjë zinxhir transporti elektronesh që mund të riparohej. Çfarëdo që konsumonte oksigjenin, po kryente diçka tjetër.

Se çfarë ishte kjo diçka tjetër, sot është përshkruar mjaft mirë. Bluja e metilenit pranon elektrone nga ekuivalentët reduktues qelizorë dhe bëhet leukoblu metileni, që rioksidohet nga oksigjeni molekular, duke mbyllur ciklin. Në rruazat e kuqe njerëzore, flavin-reduktaza e varur nga NADPH dhe reduktazat e ngjashme të disulfideve kryejnë hapin e reduktimit. Një studim i vitit 1976 me glukozë të shënuar zbuloi se ngjyruesi stimulon rrugën e heksozë-monofosfatit, se efekti në përqendrim të ulët varej nga oksihemoglobina dhe se një përqendrim më i lartë, 0.1 mM, prodhonte peroksid hidrogjeni. Një ngjyrues i reduktuar që takon oksigjenin prodhon peroksid, jo lidhje fosfatike.

Në mitokondri, tabloja është më e diskutueshme nga sa pranojnë përmbledhjet popullore. Një linjë kërkimore mbron idenë se ngjyruesi merr elektrone nga zona e kompleksit I dhe ia dorëzon citokromit c. Një tjetër zbuloi se në mitokondritë e trurit të miut ai nuk mund të rikthejë frymëmarrjen pas një bllokimi me antimicinë dhe e vendosi pranuesin e elektroneve te vendi i lidhjes së ubikinolit në kompleksin III. Një e tretë zbuloi se përqendrimet e ulëta rritnin konsumin e oksigjenit në gjendje pushimi, ndërsa frymëmarrja e stimuluar nga ADP mbetej e pandryshuar. Pohimi më i drejtpërdrejtë është se konsumi i oksigjenit i nxitur nga bluja e metilenit nuk varet fare nga fosforilimi oksidativ: ai vazhdoi kur zinxhiri respirator ishte i frenuar dhe në preparate ku ky zinxhir mungonte.

Ekzistojnë gjithashtu matje të drejtpërdrejta të hendekut midis këtyre dy madhësive. Në mitokondritë e izoluara të mëlçisë së miut të laboratorit, rritja e përqendrimeve të ngjyruesit ulte raportet e kontrollit respirator dhe shkaktonte fryrje, të cilën autorët e përshkruan si shkëputje të fosforilimit oksidativ. Në mëlçinë e perfuzuar të miut të laboratorit, bluja e metilenit rriste konsumin e oksigjenit, ndërsa raporti ATP ndaj ADP binte.

Të dhënat klinike përcjellin të njëjtin mesazh. Methemoglobinemia trajtohet me rreth një deri në dy miligramë blu metileni për kilogram, në rrugë intravenoze, përmes një rruge reduktimi të varur nga NADPH, ndërsa doza më të mëdha shkaktojnë gjendjen që po trajtohet. I njëjti rishikim vëren se efekti si antidot është më i madh në eritrocitet e paprekura dhe zvogëlohet kur ka hemolizë, çka përbën rishfaqjen e gjetjes së vitit 1930 mbi hemolizën, shtatëdhjetë e tre vjet më vonë, në një kontekst spitalor. Një përbërje, efektet e dobishme dhe të dëmshme të së cilës ndodhen në anë të kundërta të një pragu doze, nuk është një përbërje doza e së cilës duhet të nxirret nga një matje e konsumit të oksigjenit.

Pse loti duhet të jetë pjesë e diskutimit

Harrop dhe Barron vunë re diçka që ia vlen të lexohet përsëri. Vetë bluja e metilenit prodhon një brez në spektroskop midis dy brezave karakteristikë të methemoglobinës, «gjë që mund të shkaktojë lehtësisht ngatërrim gjatë një vëzhgimi të përciptë». Ngjyruesi mund të imitojë substancën që po kërkohet.

I njëjti problem ka një formë kimike. Një fenotiazinë e afërt, e pranishme si përbërës në sasi të vogël, ka sjelljen e vet të oksido-reduktimit, përshkueshmërinë e vet dhe toksicitetin e vet. Një rast i dokumentuar tregon konkretisht çfarë vihet në lojë: në një studim të jodimit të blusë së metilenit, mostrat që përmbanin rreth 7 deri në 8 për qind Azure B prodhuan kryesisht Azure B të joduar, ndaj reaksioni u dominua nga papastërtia dhe jo nga bluja e metilenit.

Kushdo që përdor blu metileni si reagent, në laborator, në një stacion ngjyrosjeje ose në akuarium, po punon me një përbërës të paspecifikuar nëse loti nuk është karakterizuar. Substancat e afërta, identiteti, papastërtitë elementare, tretësit e mbetur dhe mbetja pas kalcinimit janë pjesë e eksperimentit, jo thjesht dokumentacion shoqërues. Blupreme e siguron blunë e metilenit nga një prodhues farmaceutik dhe publikon një certifikatë të plotë analize, duke testuar të gjithë specifikimin USP dhe jo vetëm metalet e rënda; udhëzuesi për leximin e një certifikate analize dhe çfarë vërteton dhe çfarë nuk vërteton përcaktimi i gradës USP shpjegojnë si të kontrollohet dokumenti kundrejt pretendimit.

Shifra ishte e saktë

Eksperimentet e viteve 1928 dhe 1930 u kryen me kujdes, dhe vëzhgimi i tyre qendror i ka qëndruar kohës: një ngjyrues i reduktueshëm mund të bëjë që një qelizë që pothuajse nuk kryen frymëmarrje të konsumojë oksigjen me një shpejtësi shumëfish më të lartë se ajo në gjendje pushimi, pa kaluar përmes hapit që bllokon cianuri.

Gabimi shfaqet më vonë, kur «frymëmarrja» lexohet me kuptimin e saj modern. Një matje e shkëmbimit të gazeve ju tregon se elektronet arritën te oksigjeni. Nuk ju tregon se ndonjëri prej tyre u përdor për të prodhuar ATP, dhe në një qelizë pa mitokondri hendeku midis këtyre dy pohimeve është aq i madh sa mund të jetë. Harta më e gjerë e asaj që bën bluja e metilenit në qeliza e vendos të njëjtin dallim në një kuadër më të gjerë, ndërsa historia e përbërjes nga ngjyrues në ilaç shpjegon si një ngjyrues tekstilesh mbërriti fillimisht në këto eksperimente.