História metylénovej modrej: od farbiva k lieku a výskumu

Metylénová modrá sa dostala k pacientovi skôr než do lekárne.

Správa Paula Guttmanna a Paula Ehrlicha z roku 1891 o použití farbiva pri malárii obsahuje dva teplotné grafy. Druhý zachytáva obdobie od 13. júla do 5. augusta, pričom liečba je deň po dni zapísaná na okraji. Záznamy z 18. a 19. júla uvádzajú „1 × 0,05 Methylenblau“. Nasledujúce dni uvádzajú päť a sedem dávok rovnakého množstva a do 22. júla sa v zázname objavuje aj malé množstvo chinínu. Krivka horúčky, ktorá sa v prvej polovici grafu pohybuje medzi 37 °C a 39.5 °C, sa po podaní farbiva vyrovnáva a počas zostávajúcich troch týždňov zostáva približne medzi 36 °C a 37.5 °C.

Pacient bol jedným z dvoch, ktorých článok opisuje ako domáceho sluhu a námorníka. Zlúčenina, ktorú dostali, bola pätnásť rokov komerčným textilným farbivom a títo dvaja muži patria medzi prvých zaznamenaných ľudí liečených plne syntetickým liekom zameraným na konkrétny organizmus.

Najprv prišlo farbivo

Prvé komerčne úspešné syntetické farbivo vytvoril William Henry Perkin v roku 1856. Perkin mal osemnásť rokov, počas veľkonočných prázdnin pracoval v domácom laboratóriu a pokúšal sa syntetizovať chinín. Namiesto toho získal čierny zvyšok, rozpustil ho a objavil farbu, ktorá sa výborne viazala na hodváb. V auguste 1856 si ju patentoval a do konca roka 1857 už jeho továreň zásobovala londýnsku hodvábnu farbiareň.

V roku 1875 Adolf von Baeyer syntetizoval červené farbivo a nazval ho eosin podľa Eos, gréckeho slova pre úsvit. V roku 1876 Heinrich Caro, vtedy riaditeľ laboratória Badische Anilin- und Soda-Fabrik, spolu s Baeyerom vyvinul metylénovú modrú ako anilínové farbivo na bavlnu. Jej chemická štruktúra bola definitívne určená až približne o deväť rokov neskôr.

Tento pôvod je dodnes viditeľný v názve látky. „Methylene blue“ je obchodný názov z katalógu farbív, nie chemický opis. Zlúčenina, ktorú označuje, je methylthioninium chloride a rozdiely medzi názvom, soľou a jej hydrátmi začínajú byť dôležité hneď, ako niekto látku váži alebo číta jej špecifikáciu.

Farbenie bolo spojovacím článkom

Cesta z farbiarne do nemocnice viedla cez mikroskop a začala sa ešte pred existenciou metylénovej modrej. Wilhelm Erb bol prvým človekom, ktorý použil syntetické farbivo na krv, keď v roku 1865 použil kyselinu pikrovú, a v niektorých červených krvinkách pozoroval retikulárny vzor.

Doktorandská práca Paula Ehrlicha z roku 1878 porovnávala histologické farbenie s farbením textílií a tvrdila, že v oboch prípadoch ide o chemické reakcie. Pri práci pod vedením Roberta Kocha na tuberkulóznom bacile rozdelil anilínové farbivá na kyslé a zásadité triedy a preukázal, že každá trieda farbí odlišné časti bunky. V roku 1880 ich zmiešal: nasýtený roztok metylénovej modrej prilieval do kyslého fuchsínu, kým sa supernatant nevyčistil. Výsledok, ktorý nazval neutralen Farbkörper alebo neutrálne farbivo, vytvoril namiesto jednej tri farby, odhalil granuly v polymorfonukleárnych bunkách, ktoré dovtedy nebolo možné vidieť, a umožnil prvý diferenciálny počet leukocytov. Keďže tieto granuly prijímali obe zložky zmesi, Ehrlich pre bunky, ktoré ich obsahovali, vytvoril označenie neutrofil.

O dva roky neskôr Koch použil metylénovú modrú na nájdenie tuberkulózneho bacila a v roku 1883 Ehrlich túto metódu zdokonalil. V roku 1886 publikoval iný typ pozorovania: farbivo vstrekoval živým zvieratám a porovnával, ako silno ho jednotlivé orgány prijímali, pričom dospel k záveru, že má výraznú afinitu k mozgovému a nervovému tkanivu. Túto afinitu pripisoval oxidačno-redukčnému cyklovaniu farbiva, ktoré pozoroval už predchádzajúci rok. Toto cyklovanie je zároveň dôvodom, prečo roztok metylénovej modrej stráca farbu, keď sa spotrebuje jeho kyslík, a opäť ju získava po návrate vzduchu. Experimenty, ktoré ako prvé merali dôsledky tohto cyklovania patria do neskoršieho desaťročia a samotný mechanizmus je samostatnou témou odlišnou od histórie.

Parazit a fialové jadro

Alphonse Laveran objavil parazita malárie v roku 1880 pri skúmaní čerstvej, nefarbenej krvi. Na jeho bežné pozorovanie v zaschnutom nátere však bolo potrebné farbivo a vtedajšie farbiace metódy vytvárali iba červenú a modrú.

V roku 1888 poľský patológ Czesław Cheçinski nahradil kyslý fuchsín eosínom a vytvoril zmes metylénovej modrej a eosínu. Prípad, na ktorom bola jeho metóda založená, sa týkal vojaka, ktorý 30. septembra 1887 zomrel na maláriu. V krvných náteroch Cheçinski pozoroval modré útvary podobné sedmokráskam, dnes rozpoznávané ako Plasmodium malariae, a kosákovité útvary, dnes rozpoznávané ako gametocyty Plasmodium falciparum. Výsledok naraz ukončil dve konkurenčné vysvetlenia ochorenia: teóriu miazmy a tvrdenie Edwina Klebsa a Corrada Tommasi-Crudeliho, že maláriu spôsobuje baktéria.

Parazit bol viditeľný. Jeho jadro však nie, takže jeho povaha zostávala nejasná. Ernst Malachowski, lekár vo Vroclave, tento problém vyriešil najprv náhodou a potom zámerne. V roku 1889 si v jednom preparáte všimol rozdielne zafarbenie jadra plazmódia, no nedokázal ho zopakovať. Okyslenie metylénovej modrej nepomohlo. Jej alkalizovanie bóraxom vyvolalo tento efekt zakaždým. Techniku verejne predviedol 15. júna 1890 a v tom istom roku ju publikoval, pričom podrobnejšiu metódu zverejnil v auguste 1891.

Dmitri Romanowsky publikoval svoju vlastnú verziu v septembri 1891. Najlepšie výsledky získal zo zanedbanej, plesnivej fľaše roztoku metylénovej modrej staršej ako dva mesiace. Malachowského postup bol zámerný a podľa jeho slov ľahko reprodukovateľný; Romanowského postup bol slepou uličkou, ktorá zafungovala raz. Eponym však napriek tomu pripadol Romanowskému a spor o to, kto vytvoril fialové zafarbenie, ktoré zviditeľnilo jadro je samostatný príbeh s vlastnými dokumentmi.

Obrázok: druhý teplotný graf zo správy Guttmanna a Ehrlicha z roku 1891. Horný panel zachytáva obdobie od 13. do 24. júla a dolný od 25. júla do 5. augusta; záznamy na okraji uvádzajú podané dávky a počas posledných troch týždňov záznamu zostáva teplota blízko normálu. Reprodukované zo správy naskenovanej pre Kraftsa, Hempelmanna a Skórsku-Staniu, Parasitology Research 111:1–6 (2012), PMID 22411634.

Ukázalo sa, že „dozrievanie“ je demetylácia

Nikto zo zainteresovaných v 90. rokoch 19. storočia nevedel, čo „dozrievanie“ robí s metylénovou modrou. Odpoveď priniesla priemyselná chémia. Heinrich August Bernthsen v roku 1883 syntetizoval materskú zlúčeninu fenotiazín, v roku 1885 preukázal, že metylénová modrá patrí do tejto skupiny, a v rovnakom období ukázal, že zásadité podmienky odstraňujú z farbiva metylové skupiny, čím vznikajú zlúčeniny dnes označované ako azúry.

Bernard Nocht izoloval aktívnu frakciu v rokoch 1898 a 1899 a dokázal ju pomenovať iba Rot aus Methylenblau, červená z metylénovej modrej. Michaelis ju v roku 1901 identifikoval ako azure I. Jenner v roku 1899 zaviedol absolútny metanol ako rozpúšťadlo zrazeniny farbiva, čím odstránil potrebu tepelnej fixácie krvných náterov; Leishman a Reuter spojili obe inovácie; Wright v roku 1902 publikoval zjednodušenú metódu. Giemsovým prínosom, takisto z roku 1902, bolo prestať sa spoliehať na náhodne dozretý roztok a namiesto toho používať odmerané množstvá známych farbív. Následne odmietol zverejniť spôsob výroby čistého methylene azure a metódu predal laboratóriu Dr. Grüblera, ktoré produkt uvádzalo na trh ako azure I a tvrdilo, že iba jeho verzia je autentickým Giemsovým farbivom.

Dve svetové vojny túto prácu nechtiac dokončili. Keď sa nemecké farbivá stali nedostupnými, Lillie, Roe a Wilcox pracovali s americkými náhradami a zistili, že najlepšie farbenie vzniká z troch oddelených zložiek: čistej metylénovej modrej, jej rozkladného produktu azure B a eosínu. Tieto tri látky zostávajú hlavnými zložkami farbiva používaného na diagnostiku malárie dodnes pod názvom, ktorý dnes spája Malachowského, Wrighta a Giemsu.

Obrázok: prstencové formy Plasmodium falciparum v ľudských červených krvinkách, zafarbené metódou Romanowského typu. Fialová štruktúra vo vnútri prstenca je chromatín, ktorý Malachowského metylénová modrá upravená bóraxom po prvý raz zviditeľnila. Obrázok od Ernsta Hempelmanna, uvoľnený ako voľné dielo.

Jeden názov, viacero materiálov

Roky, počas ktorých sa tieto zložky od seba oddeľovali, zanechali problém, ktorý pretrval dlhšie než samotná chémia. Ralph Lillie v roku 1969 jasne rozlíšil biologické farbivá, „vyrábané podľa prísnych špecifikácií zodpovedajúcich ich citlivému a náročnému použitiu“, od nebiologických farbív na farbenie textílií, ktoré „vyžadujú menej prísne a náročné výrobné štandardy“. Oba druhy výrobkov niesli rovnaký názov a rozdiel medzi nimi nikdy nebol iba otázkou stupňa. Špecifikácia vytvorená pre bavlnu a špecifikácia vytvorená pre diagnostické činidlo nie sú zameniteľné a materiál vyrobený podľa textilnej špecifikácie nebol určený na prehltnutie.

Azure B je najjasnejším príkladom. Je to monodemetylovaná forma metylénovej modrej, má vlastnú merateľnú farmakologickú aktivitu a viac ako storočie bola prítomná ako nekontrolovaná zložka klinických prípravkov metylénovej modrej, kým ich niekto od seba oddelil. Jedna skupina zistila, že ľudské tkanivo odobraté pri pitve po podaní metylénovej modrej obsahovalo 5 až 14 per cent nezmenenej metylénovej modrej a 86 až 95 per cent azure B. To, či má konkrétny prípravok obsahovať azure B a v akom limite, je otázkou špecifikácie a výskum azure B ako nečistoty a metabolitu na to nadväzuje.

Praktický dôsledok sa nachádza práve v špecifikácii. Zhoda s USP je cestou k najvyššej čistote, ktorú trh ponúka, pretože ide o úplný publikovaný skúšobný štandard, nie o jedno meranie. Zahŕňa identitu, stanovenie obsahu, organické nečistoty vrátane azúrových farbív, zvyškové rozpúšťadlá, elementárne nečistoty, zvyšok po žíhaní, mikrobiologické limity a bakteriálne endotoxíny. Certifikát, ktorý uvádza výsledok skúšky na ťažké kovy a označuje ho za zhodu s USP, uviedol iba jednu položku z tohto zoznamu.

Blupreme získava svoju metylénovú modrú od farmaceutického výrobcu a zverejňuje úplný certifikát analýzy, pričom testuje celú špecifikáciu USP, nielen ťažké kovy. Sprievodca čítaním certifikátu analýzy a to, čo označenie USP preukazuje a čo nepreukazuje vysvetľujú, ako dokument porovnať s príslušným tvrdením.

Čo história oprávňuje tvrdiť a čo nie

Táto vývojová línia je skutočná a dlhšia, než naznačuje väčšina produktových stránok. Metylénová modrá bola v roku 1891 použitá pri liečbe malárie, v roku 1899 bola opísaná ako sedatívum pri agitovanej psychóze a jej postranný reťazec vedie cez quinacrine, chloroquine, promethazine a chlorpromazine. Ehrlichov článok z roku 1890 s Arthurom Leppmannom opisoval úľavu od neuralgickej a reumatickej bolesti a následne zvažoval, no odmietol testovať farbivo pri duševných ochoreniach.

Nič z toho nepreukazuje moderné použitie. Výsledok pri malárii z roku 1891 predstavovali dvaja pacienti a teplotný graf. Dlhodobá znalosť molekuly je dôvodom na jej skúmanie, nie výsledkom. História zlúčeniny ako lieku a moderné klinické skúšania pri malárii odpovedajú na iné otázky než tie, ktoré kládol Ehrlich, a ich koncové ukazovatele treba posudzovať podľa ich vlastných kritérií.

V záznamoch je jeden detail, ktorý patrí skôr súčasnosti než minulosti. Keď výskumníci v 2000s uskutočňovali skúšania metylénovej modrej pri malárii v Burkina Faso, museli súťažiť o materiál farmaceutickej kvality a uviedli, že cena suroviny po získaní validácie GMP vzrástla približne stonásobne. Farbivo bolo možné nahradiť. Liek nie. Rozdiel, ktorý Lillie definoval v roku 1969, je ten istý rozdiel, ktorý dnes rozhoduje o tom, čo fľaša obsahuje.