Istoria albastrului de metilen: de la colorant la medicament și cercetare

Albastrul de metilen a ajuns la un pacient înainte de a ajunge într-o farmacie.

Raportul din 1891 al lui Paul Guttmann și Paul Ehrlich privind utilizarea colorantului în malarie conține două grafice de temperatură. Al doilea acoperă perioada 13 iulie–5 august, iar tratamentul este notat pe margine, zi de zi. Înregistrările din 18 și 19 iulie spun „1 × 0,05 Methylenblau”. În zilele următoare sunt trecute cinci și șapte doze din aceeași cantitate, iar până la 22 iulie în înregistrare apare și o cantitate mică de chinină. Curba febrei, care oscilează între 37 °C și 39.5 °C în prima jumătate a graficului, se aplatizează după apariția colorantului și rămâne între aproximativ 36 °C și 37.5 °C în cele trei săptămâni rămase.

Pacientul era unul dintre cei doi descriși în lucrare drept un servitor domestic și un marinar. Compusul pe care l-au primit fusese timp de cincisprezece ani un colorant textil comercial, iar cei doi bărbați se numără printre primele persoane despre care există consemnări că au fost tratate cu un medicament complet sintetic destinat unui organism specific.

Colorantul a fost primul

Primul colorant sintetic cu succes comercial a fost creat de William Henry Perkin în 1856. Perkin avea optsprezece ani, lucra într-un laborator amenajat acasă în timpul vacanței de Paște și încerca să sintetizeze chinina. În schimb, a obținut un reziduu negru, l-a dizolvat și a descoperit o culoare care se fixa intens pe mătase. A brevetat-o în august 1856, iar până la sfârșitul anului 1857 avea o fabrică ce aproviziona o vopsitorie de mătase din Londra.

În 1875, Adolf von Baeyer a sintetizat un colorant roșu și l-a numit eosină, de la Eos, cuvântul grecesc pentru zori. În 1876, Heinrich Caro, pe atunci director al laboratorului de la Badische Anilin- und Soda-Fabrik, a dezvoltat albastrul de metilen împreună cu Baeyer ca un colorant pe bază de anilină pentru bumbac. Structura sa chimică nu a fost stabilită definitiv decât aproximativ nouă ani mai târziu.

Această origine este încă vizibilă în modul în care este denumită substanța. „Albastru de metilen” este o denumire comercială provenită din catalogul de coloranți, nu o descriere chimică. Compusul la care se referă este clorura de metiltioniniu, iar diferențele dintre denumire, sare și hidrații săi devin importante imediat ce cineva cântărește materialul sau citește o specificație.

Colorarea a fost puntea

Drumul de la vopsitorie la spital a trecut prin microscop și a început înainte ca albastrul de metilen să existe. Wilhelm Erb a fost prima persoană care a aplicat un colorant sintetic pe sânge, folosind acid picric în 1865, și a observat un model reticular în interiorul unor eritrocite.

Teza de doctorat a lui Paul Ehrlich din 1878 compara colorarea histologică cu vopsirea textilelor și susținea că ambele sunt reacții chimice. Lucrând sub îndrumarea lui Robert Koch asupra bacilului tuberculozei, el a împărțit coloranții de anilină în clase acide și bazice și a stabilit că fiecare clasă colora părți diferite ale unei celule. În 1880, le-a amestecat: o soluție saturată de albastru de metilen turnată în fuxină acidă până când supernatantul devenea limpede. Rezultatul, pe care l-a numit neutralen Farbkörper sau colorant neutru, producea trei culori în loc de una, evidenția granule din celulele polimorfonucleare care nu fuseseră vizibile până atunci și a făcut posibilă prima formulă leucocitară diferențială. Deoarece acele granule captau ambele componente ale amestecului, Ehrlich a creat termenul neutrofil pentru celulele care le conțineau.

Doi ani mai târziu, Koch a folosit albastru de metilen pentru a identifica bacilul tuberculozei, iar în 1883 Ehrlich a îmbunătățit metoda. În 1886, el a publicat un alt tip de observație: a injectat colorantul în animale vii și a comparat intensitatea cu care fiecare organ îl capta, concluzionând că acesta avea o afinitate pronunțată pentru țesutul cerebral și nervos. El a atribuit această afinitate ciclului de oxidare-reducere al colorantului, pe care îl observase în anul precedent. Acest ciclu explică și de ce o soluție de albastru de metilen își pierde culoarea atunci când oxigenul este consumat și o recapătă când aerul revine. Experimentele care au măsurat pentru prima dată consecințele acestui ciclu aparțin unui deceniu ulterior, iar mecanismul în sine este un subiect separat de istorie.

Parazitul și nucleul violet

Alphonse Laveran a descoperit parazitul malariei în 1880 examinând sânge proaspăt, necolorat. Pentru a-l vedea în mod obișnuit într-un frotiu uscat era necesară o colorație, iar colorațiile vremii produceau doar roșu și albastru.

În 1888, patologul polonez Czesław Cheçinski a înlocuit fuxina acidă cu eosină, obținând un amestec de albastru de metilen și eosină. Cazul care a stat la baza metodei sale a fost cel al unui soldat care murise de malarie la 30 septembrie 1887. În frotiurile de sânge, Cheçinski a observat forme albastre asemănătoare unor margarete, recunoscute astăzi drept Plasmodium malariae, și forme în seceră, recunoscute astăzi drept gametocitele de Plasmodium falciparum. Rezultatul a înlăturat simultan două explicații concurente ale bolii: teoria miasmelor și afirmația lui Edwin Klebs și Corrado Tommasi-Crudeli potrivit căreia malaria era provocată de o bacterie.

Parazitul era vizibil. Nucleul lui nu era, ceea ce lăsa natura sa neclară. Ernst Malachowski, medic în Breslau, a rezolvat problema mai întâi accidental, apoi deliberat. În 1889, a observat colorarea diferențială a nucleului plasmodial într-un preparat și nu a reușit să o reproducă. Acidifierea albastrului de metilen nu a ajutat. Alcalinizarea lui cu borax producea efectul de fiecare dată. A demonstrat public tehnica la 15 iunie 1890 și a publicat-o în același an, urmată de o metodă mai detaliată în august 1891.

Dmitri Romanowsky și-a publicat propria versiune în septembrie 1891. Cele mai bune rezultate ale sale au provenit dintr-o sticlă neglijată și mucegăită de soluție de albastru de metilen, veche de mai mult de două luni. Descrierea lui Malachowski era deliberată și, după propriile sale cuvinte, ușor reproductibilă; cea a lui Romanowsky era o fundătură care funcționase o singură dată. Totuși, eponimul i-a revenit lui Romanowsky, iar disputa privind cine a produs violetul care a făcut nucleul vizibil este o poveste separată, cu propriile sale documente.

Figura: al doilea grafic de temperatură din raportul lui Guttmann și Ehrlich din 1891. Panoul superior acoperă perioada 13–24 iulie, iar cel inferior 25 iulie–5 august; însemnările de pe margine indică dozele administrate, iar temperatura rămâne aproape de normal în ultimele trei săptămâni ale înregistrării. Reprodus din raportul scanat pentru Krafts, Hempelmann și Skórska-Stania, Parasitology Research 111:1–6 (2012), PMID 22411634.

„Maturarea” s-a dovedit a fi demetilare

Nimeni dintre cei implicați în anii 1890 nu știa ce făcea „maturarea” albastrului de metilen. Răspunsul a venit din chimia industrială. Heinrich August Bernthsen sintetizase compusul de bază fenotiazină în 1883, stabilise în 1885 că albastrul de metilen aparținea acestei familii și demonstrase în aceeași perioadă că mediile alcaline elimină grupări metil din colorant, producând compușii numiți astăzi azuri.

Bernard Nocht a extras fracția activă în 1898 și 1899 și a putut doar să o numească Rot aus Methylenblau, roșu din albastru de metilen. Michaelis a identificat-o drept azur I în 1901. Jenner a introdus metanolul absolut ca solvent pentru precipitatul de colorant în 1899, eliminând necesitatea fixării termice a frotiurilor de sânge; Leishman și Reuter au combinat cele două progrese; Wright a publicat o metodă simplificată în 1902. Contribuția lui Giemsa, tot din 1902, a fost să nu se mai bazeze pe o soluție maturată aleatoriu și să folosească în schimb cantități măsurate de coloranți cunoscuți. Ulterior, el a refuzat să publice modul în care producea azur de metilen pur și a vândut metoda laboratorului Dr. Grübler, care a comercializat produsul drept azur I și a susținut că numai versiunea sa era colorația Giemsa autentică.

Două războaie mondiale au încheiat procesul din întâmplare. Când coloranții germani au devenit imposibil de obținut, Lillie, Roe și Wilcox au lucrat cu înlocuitorii americani și au constatat că cea mai bună colorare provenea din trei componente separate: albastru de metilen pur, produsul său de degradare Azure B și eosină. Aceste trei componente rămân principalele componente ale colorației utilizate astăzi pentru diagnosticarea malariei, sub o denumire care îi reunește acum pe Malachowski, Wright și Giemsa.

Figura: forme inelare de Plasmodium falciparum în eritrocite umane, colorate printr-o metodă de tip Romanowsky. Structura violet din interiorul inelului este cromatina pe care albastrul de metilen tratat cu borax al lui Malachowski a făcut-o vizibilă pentru prima dată. Imagine realizată de Ernst Hempelmann, pusă la dispoziție în domeniul public.

Un singur nume, mai multe materiale

Anii care au separat aceste componente au lăsat în urmă o problemă care a supraviețuit chimiei. Ralph Lillie a trasat în 1969 distincția dintre coloranții biologici, „fabricați conform unor specificații stricte, adecvate utilizărilor lor delicate și exigente”, și coloranții nebiologici pentru textile, care „necesită standarde de fabricație mai puțin riguroase și exigente”. Ambele tipuri de produse purtau aceeași denumire, iar diferența dintre ele nu a fost niciodată doar una de grad. O specificație redactată pentru bumbac și una redactată pentru un reactiv de diagnostic nu sunt interschimbabile, iar un material fabricat conform celei textile nu era destinat ingerării.

Azure B este cea mai clară ilustrare. Este forma monodemetilată a albastrului de metilen, are o activitate farmacologică proprie măsurabilă și a fost prezent ca element necontrolat în preparatele clinice cu albastru de metilen timp de peste un secol înainte ca cineva să le separe. Un grup a constatat că țesutul uman prelevat la autopsie după administrarea de albastru de metilen conținea 5 până la 14 la sută albastru de metilen nemodificat și 86 până la 95 la sută Azure B. Dacă un anumit preparat ar trebui să conțină Azure B și în ce limită este o chestiune de specificație, iar cercetările privind Azure B ca impuritate și metabolit continuă subiectul de aici.

Tot în specificație se găsește și consecința practică. Conformitatea cu USP este calea către cel mai înalt nivel de puritate oferit de piață, deoarece reprezintă un standard complet de testare publicat, nu o singură măsurătoare. Acesta acoperă identitatea, dozarea, impuritățile organice inclusiv coloranții azur, solvenții reziduali, impuritățile elementare, reziduul la calcinare, limitele microbiene și endotoxinele bacteriene. Un certificat care raportează rezultatul unui test pentru metale grele și îl numește conformitate USP a raportat doar un singur element din această listă.

Blupreme își procură albastrul de metilen de la un producător farmaceutic și publică certificatul complet de analiză, testând întreaga specificație USP, nu doar metalele grele. Ghidul pentru citirea unui certificat de analiză și ce stabilește și ce nu stabilește desemnarea USP explică modul în care documentul poate fi verificat în raport cu afirmația.

Ce permite istoria să afirmăm și ce nu

Filiația este reală și este mai lungă decât sugerează majoritatea paginilor de produs. Albastrul de metilen a fost utilizat pentru tratarea malariei în 1891, a fost raportat ca sedativ în psihoza agitată în 1899, iar lanțul său lateral continuă prin quinacrină, clorochină, prometazină și clorpromazină. Lucrarea lui Ehrlich din 1890 împreună cu Arthur Leppmann descria ameliorarea durerii nevralgice și reumatice, apoi lua în considerare utilizarea colorantului în bolile mintale și decidea să nu o testeze.

Nimic din toate acestea nu stabilește o utilizare modernă. Rezultatul din 1891 privind malaria se baza pe doi pacienți și un grafic de temperatură. Familiaritatea îndelungată cu o moleculă este un motiv pentru a o studia, nu un rezultat. Istoria compusului ca medicament și studiile moderne privind malaria răspund unor întrebări diferite de cele pe care le punea Ehrlich, iar criteriile de evaluare trebuie interpretate în termenii lor proprii.

Există un detaliu în documentele istorice care ține mai degrabă de prezent decât de trecut. Când cercetătorii au desfășurat studii cu albastru de metilen pentru malarie în Burkina Faso în anii 2000, s-au trezit concurând pentru material de calitate farmaceutică și au raportat că prețul materiei prime crescuse de aproximativ o sută de ori după ce aceasta a primit validare GMP. Un colorant putea fi înlocuit. Un medicament nu. Distincția trasată de Lillie în 1969 este aceeași care determină ce conține o sticlă astăzi.