As experiências que ligaram o azul de metileno à respiração celular

O sangue humano desfibrinado, aquecido a 37 °C durante três horas, consome cerca de dois por cento do oxigénio que contém. Adicione uma pequena quantidade de azul de metileno antes da incubação, e o mesmo sangue consome cerca de sessenta e cinco por cento. Nada nas células mudou. Apenas a solução mudou.

Esse número vem de um artigo de 1928 de George Harrop e E. S. Guzman Barron, da Johns Hopkins, e está na origem da afirmação, amplamente repetida, de que o azul de metileno melhora a respiração celular. A afirmação não é falsa, mas é mais restrita do que parece.

O que o número da tabela realmente mede

O parâmetro final era a captação de oxigénio, determinada por análise de gases. Harrop e Barron filtraram sangue recém-colhido através de algodão a 10 °C para remover os glóbulos brancos, saturaram a amostra com oxigénio, dividiram-na, adicionaram corante a uma das porções e analisaram ambas após a incubação. As contagens de leucócitos raramente ultrapassavam cerca de mil por milímetro cúbico. O consumo de oxigénio era indicado como a proporção do conteúdo inicial de oxigénio da amostra que tinha desaparecido.

Também mediram dióxido de carbono, e aí o método revelou as suas limitações. O sangue desfibrinado libertava até dois milimoles de dióxido de carbono por 100 mL na primeira hora de incubação por motivos não relacionados com a reação em estudo, pelo que os quocientes respiratórios obtidos com sangue total eram inutilizáveis. Apenas células lavadas em solução de Locke produziram valores interpretáveis, agrupados entre 0.73 e 0.80 com e sem o corante.

Este pormenor não é irrelevante. Nestes artigos, "respiração" significa troca gasosa dentro de um recipiente fechado. A diferença entre consumo de oxigénio e produção útil de energia é analisada separadamente em o que o consumo de oxigénio diz e não diz sobre o ATP.

O corante teve maior efeito onde as células menos respiravam

Os eritrócitos maduros de mamíferos têm um consumo de oxigénio mensurável quase inexistente. Os eritrócitos nucleados das aves têm-no. Harrop e Barron estudaram ambos, e esse contraste constitui a base do seu argumento.

Nas amostras de mamíferos, o corante produziu aumentos de vinte a cinquenta vezes. No sangue de ganso, cujas células já respiravam, a taxa nunca chegou sequer a duplicar. Quanto maior era a respiração inicial, menos o corante conseguia acrescentar.

O mesmo gradiente surge dentro de uma única espécie. Uma amostra humana de um doente com policitemia vera, contendo células imaturas, consumiu 11.3 por cento do seu oxigénio sem corante presente, contra 2.8 por cento nas células lavadas de um dador saudável. O corante elevou esse valor apenas para 63.4 por cento, uma aceleração de seis vezes num contexto em que as células normais aceleraram quase trinta vezes. O corante aproximou as células maduras do comportamento das células imaturas, que é precisamente o que os autores afirmaram que estava a fazer.

O cianeto deveria tê-lo impedido

Sabia-se que o cianeto interrompia a oxidação celular. Harrop e Barron adicionaram-no na mesma, juntamente com o corante.

Os resultados com sangue bovino são representativos. O teor de oxigénio desceu de 22.61 para 22.03 volumes por cento ao longo de três horas sem quaisquer adições. Com azul de metileno, desceu para 12.84. Com azul de metileno e cianeto de potássio numa concentração molar de um para cinco mil, desceu para 12.74. O efeito do corante ficou essencialmente inalterado.

Figura: um registo contínuo de microrrespiração de eritrócitos humanos. A seta assinala a adição de azul de metileno. Antes, o traçado é quase plano; depois, sobe de forma constante. Reproduzido de Harrop e Barron, Journal of Experimental Medicine 48:207–223 (1928), PMID 19869478.

A conclusão dos autores foi que o corante atuava como transportador de oxigénio, "fornecendo uma substância que desapareceu dos eritrócitos adultos não nucleados dos mamíferos." Dois anos depois, Michaelis e Salomon, no Rockefeller Institute, formularam a divergência na forma que viria a perdurar. Ou o efeito do corante era "uma propriedade acidental do corante", ou o corante era "um modelo de alguma substância desconhecida nos organismos." Essa questão continua em aberto. O que mudou é que hoje as células podem ser descritas com muito maior precisão.

Um extrato de fígado fez o mesmo

Michaelis e Salomon demonstraram que extratos de órgãos preparados com água fria produzem a mesma estimulação. O fígado de rato teve o efeito mais forte, seguido do rim, baço e testículo. O cérebro, músculo e soro sanguíneo tiveram pouco ou nenhum efeito.

Em seguida, testaram o extrato contra monóxido de carbono. A respiração induzida pelo extrato ou pelo corante permaneceu inalterada numa mistura de 98 por cento de monóxido de carbono e 2 por cento de oxigénio. A mesma mistura gasosa inibiu a respiração da levedura e a dos eritrócitos nucleados de aves em cerca de 60 a 80 por cento, em concordância com a descrição de Warburg de um fermento respiratório sensível ao monóxido de carbono. A substância tecidular não identificada não era, portanto, a enzima de Warburg.

Várias identidades candidatas foram sendo excluídas. A glutationa reduzida e a cisteína produziram apenas o consumo de oxigénio necessário à sua própria oxidação. A coenzima de Harden e Young foi excluída porque o músculo contém a maior quantidade e apresentou quase o menor efeito. O citocromo de Keilin, assim denominado alguns anos antes, deparou-se com a mesma contradição. A própria sugestão dos autores, de que a substância ativa provinha do núcleo celular, foi por eles descrita como mera sugestão.

O efeito dependia de determinadas condições

As células tinham de permanecer intactas. A hemólise provocada por água destilada ou por congelação repetida eliminava a resposta tanto ao corante como ao extrato, e a hemólise parcial reduzia-a proporcionalmente.

Também era necessário açúcar. Glicose, frutose e sacarose sustentavam a respiração induzida pelo corante; o manitol não. Sem açúcar presente, não havia qualquer respiração, e o corante parecia danificar as células durante o processo, de modo que a adição de glicose uma ou duas horas mais tarde não a restabelecia. Os autores sugeriram que o corante estava a oxidar um componente estrutural de que a célula necessitava.

A iluminação aumentava consideravelmente o efeito do corante, embora o efeito também fosse claro no escuro. Outros corantes redutíveis comportavam-se de forma diferente: o azul de toluileno igualava ou superava o azul de metileno, enquanto o dissulfonato de índigo quase não produzia efeito. Não surgiu qualquer relação clara entre o potencial de oxidação-redução de um corante e a magnitude do seu efeito, o que os autores atribuíram à permeabilidade da membrana e à toxicidade.

O efeito acompanhava a fermentação, não a respiração

O estudo de Barron de 1930 passou das suspensões celulares para cortes de tecido de órgãos normais de rato e tumores transplantados.

Nos tecidos sem glicólise aeróbia, o azul de metileno não teve efeito ou suprimiu ligeiramente o consumo de oxigénio: rim em cerca de 14 por cento, pâncreas em cerca de 14 por cento, fígado em cerca de 5 por cento. Nos tecidos que fermentam na presença de oxigénio, aumentou o consumo: baço em cerca de 8 por cento, cérebro em cerca de 13 por cento. Nos tumores, os aumentos variaram de cerca de 27 por cento num carcinoma mamário humano a mais de 80 por cento num sarcoma de Rous de galinha, aproximadamente em proporção com a glicólise aeróbia de cada tecido.

Figura: cada ponto corresponde a um tipo de tecido. O eixo horizontal representa a glicólise aeróbia; o eixo vertical representa a alteração do consumo de oxigénio após a administração de azul de metileno. Dados de Barron, Journal of Experimental Medicine 52:447–456 (1930), Tabela 6, PMID 19869777.

A experiência com cianeto produziu então a imagem inversa. Quando a respiração desses tecidos anteriormente não responsivos foi bloqueada com cianeto e a fermentação se tornou evidente, o corante voltou a aumentar o consumo de oxigénio: rim em cerca de 59 por cento, fígado em cerca de 19 por cento, baço em cerca de 286 por cento, testículo em cerca de 200 por cento.

Barron propôs que o corante poderia servir como teste da capacidade fermentativa de uma célula ou tecido e terminou com uma especulação: gerações sucessivas de culturas tumorais num meio contendo o corante poderiam um dia tornar o metabolismo de um tumor permanentemente semelhante ao do tecido normal. Essa era uma questão de investigação formulada em 1930. Não é uma alegação terapêutica.

O que as experiências não poderiam ter medido

Em 1928 e 1930, "respiração" significava consumo de oxigénio. O trifosfato de adenosina foi descrito pela primeira vez em 1929, e a demonstração de que mitocôndrias isoladas esterificam fosfato enquanto transferem eletrões surgiu em 1949. Nenhum dos primeiros artigos sobre azul de metileno poderia ter medido a produção de energia, e nenhum afirmou fazê-lo.

As células constituem o segundo problema. Os eritrócitos maduros de mamíferos não contêm mitocôndrias. Durante a fase de reticulócito, eliminam mitocôndrias e ribossomas por autofagia seletiva, razão pela qual um glóbulo vermelho maduro funciona com base na glicólise e depende da via das pentoses-fosfato sobretudo para produzir NADPH, e não ATP. Nas experiências de 1928, não existia qualquer cadeia de transporte de eletrões para reparar. O que quer que estivesse a consumir o oxigénio estava a fazer outra coisa.

Hoje, essa outra coisa está razoavelmente bem descrita. O azul de metileno aceita eletrões de equivalentes redutores celulares e transforma-se em leucoazul de metileno, que é reoxidado pelo oxigénio molecular, fechando o ciclo. Nos glóbulos vermelhos humanos, a redutase de flavina dependente de NADPH e redutases de dissulfureto relacionadas realizam a etapa de redução. Um estudo de 1976 com glicose marcada concluiu que o corante estimula a via das hexoses-monofosfato, que o efeito a baixa concentração dependia da oxi-hemoglobina e que uma concentração mais elevada, 0.1 mM, gerava peróxido de hidrogénio. Um corante reduzido que entra em contacto com oxigénio produz peróxido, não ligações de fosfato.

Nas mitocôndrias, o quadro é mais controverso do que deixam entender os resumos populares. Uma linha de investigação sustenta que o corante recebe eletrões da região do complexo I e os transfere para o citocromo c. Outro estudo concluiu que, em mitocôndrias de cérebro de ratinho, não consegue restaurar a respiração após um bloqueio por antimicina e situou, em vez disso, o aceitador de eletrões no local de ligação da ubiquinona reduzida do complexo III. Um terceiro estudo concluiu que baixas concentrações aumentavam o consumo de oxigénio em repouso, mantendo inalterada a respiração estimulada por ADP. A formulação mais direta desta questão é que o consumo de oxigénio induzido pelo azul de metileno não depende de todo da fosforilação oxidativa: persistiu quando a cadeia respiratória foi inibida e em preparações que nem sequer a possuíam.

Também existem medições diretas da diferença entre as duas grandezas. Em mitocôndrias isoladas de fígado de rato, concentrações crescentes do corante reduziram os rácios de controlo respiratório e causaram edema, fenómeno que os autores descreveram como desacoplamento da fosforilação oxidativa. Em fígado de rato perfundido, o azul de metileno aumentou o consumo de oxigénio enquanto o rácio ATP-ADP diminuiu.

O registo clínico transmite a mesma mensagem. A metemoglobinemia é tratada com aproximadamente um a dois miligramas de azul de metileno por quilograma por via intravenosa, através de uma via de redução dependente de NADPH, e doses superiores causam a própria condição que está a ser tratada. A mesma revisão refere que o efeito antidótico é maior em eritrócitos intactos e diminui na presença de hemólise, reproduzindo num contexto hospitalar, setenta e três anos depois, a observação de 1930 sobre a hemólise. Um composto cujos efeitos úteis e nocivos se encontram em lados opostos de um limiar de dose não é um composto cuja dose deva ser inferida a partir de uma medição do consumo de oxigénio.

Por que razão o lote faz parte da discussão

Harrop e Barron repararam num aspeto que merece uma segunda leitura. O próprio azul de metileno produz no espectroscópio uma banda entre as duas bandas características da metemoglobina, "que pode facilmente causar confusão numa observação superficial." O corante pode imitar a substância que se procura.

O mesmo problema existe sob forma química. Uma fenotiazina relacionada presente como constituinte minoritário tem o seu próprio comportamento redox, a sua própria permeabilidade e a sua própria toxicidade. Um caso documentado torna as implicações concretas: num estudo sobre a iodação do azul de metileno, amostras contendo aproximadamente 7 a 8 por cento de Azure B produziram principalmente Azure B iodado, pelo que a impureza, e não o azul de metileno, dominou a reação.

Qualquer pessoa que utilize azul de metileno como reagente, num laboratório, numa bancada de coloração ou num aquário, está a trabalhar com um ingrediente não especificado se o lote não tiver sido caracterizado. Substâncias relacionadas, identidade, impurezas elementares, solventes residuais e resíduo após ignição fazem parte da experiência, em vez de serem mera documentação à sua volta. A Blupreme obtém o seu azul de metileno junto de um fabricante farmacêutico e publica um certificado de análise completo, testando toda a especificação USP em vez de apenas metais pesados; o guia para ler um certificado de análise e o que a designação de grau USP estabelece e não estabelece explicam como verificar o documento face à alegação.

O número estava certo

As experiências de 1928 e 1930 foram cuidadosas, e a sua observação central resistiu ao tempo: um corante redutível pode fazer com que uma célula que quase não respira consuma oxigénio a uma taxa muitas vezes superior à de repouso, sem passar pela etapa que o cianeto bloqueia.

O erro surge mais tarde, quando "respiração" é interpretada segundo o seu significado moderno. Uma medição de trocas gasosas indica que os eletrões chegaram ao oxigénio. Não indica que qualquer um deles tenha sido utilizado para produzir ATP e, numa célula sem mitocôndrias, a distância entre essas duas afirmações é tão grande quanto possível. O mapa mais abrangente do que o azul de metileno faz nas células coloca a mesma distinção num contexto mais amplo, e a história do composto, de corante a medicamento explica como um corante têxtil chegou, em primeiro lugar, a estas experiências.