Sejarah metilena biru: daripada pewarna kepada ubat dan penyelidikan

Metilena biru sampai kepada pesakit sebelum sampai ke farmasi.

Laporan 1891 oleh Paul Guttmann dan Paul Ehrlich mengenai penggunaan pewarna itu dalam malaria mengandungi dua carta suhu. Carta kedua merangkumi 13 Julai hingga 5 Ogos, dengan rawatan ditulis di sepanjang margin hari demi hari. Catatan pada 18 dan 19 Julai berbunyi "1 × 0,05 Methylenblau". Hari-hari berikutnya menyenaraikan lima dan tujuh dos dengan jumlah yang sama, dan menjelang 22 Julai sejumlah kecil kuinin turut tercatat. Garis demam, yang turun naik antara 37 °C dan 39.5 °C sepanjang separuh pertama carta, menjadi mendatar selepas pewarna itu diberikan dan kekal antara kira-kira 36 °C dan 37.5 °C selama baki tiga minggu.

Pesakit itu ialah salah seorang daripada dua orang, yang diterangkan dalam makalah tersebut sebagai seorang pembantu rumah dan seorang kelasi. Sebatian yang mereka terima telah menjadi pewarna tekstil komersial selama lima belas tahun, dan kedua-dua lelaki itu termasuk antara individu terawal yang direkodkan menerima rawatan dengan ubat sintetik sepenuhnya yang ditujukan kepada organisma tertentu.

Pewarna datang dahulu

Pewarna sintetik pertama yang berjaya secara komersial dicipta oleh William Henry Perkin pada 1856. Perkin berumur lapan belas tahun, bekerja di makmal rumah semasa cuti Easter, dan cuba mensintesis kuinin. Sebaliknya, dia memperoleh sisa hitam, melarutkannya, dan menemui warna yang melekat dengan cemerlang pada sutera. Dia mempatenkannya pada Ogos 1856 dan pada penghujung 1857 sudah mempunyai sebuah kilang yang membekalkan sebuah kilang pencelupan sutera di London.

Pada 1875 Adolf von Baeyer mensintesis pewarna merah dan menamakannya eosin, daripada Eos, perkataan Yunani untuk fajar. Pada 1876 Heinrich Caro, ketika itu pengarah makmal di Badische Anilin- und Soda-Fabrik, membangunkan metilena biru bersama Baeyer sebagai pewarna berasaskan anilina untuk kapas. Struktur kimianya hanya dipastikan kira-kira sembilan tahun kemudian.

Asal usul itu masih dapat dilihat pada cara bahan tersebut dinamakan. "Methylene blue" ialah nama dagangan daripada katalog pewarna, bukannya penerangan kimia. Sebatian yang dirujuknya ialah metiltioninium klorida, dan perbezaan antara nama, garam, dan hidratnya menjadi penting sebaik sahaja seseorang menimbang bahan itu atau membaca spesifikasi.

Pewarnaan menjadi penghubung

Laluan dari kilang pewarna ke hospital melalui mikroskop, dan ia bermula sebelum metilena biru wujud. Wilhelm Erb ialah orang pertama yang menggunakan pewarna sintetik pada darah, dengan menggunakan asid pikrik pada 1865, dan melihat corak retikular di dalam beberapa sel merah.

Tesis kedoktoran Paul Ehrlich pada 1878 membandingkan pewarnaan histologi dengan pencelupan tekstil dan berhujah bahawa kedua-duanya ialah tindak balas kimia. Ketika bekerja di bawah Robert Koch pada basil tuberkel, dia mengelaskan pewarna anilina kepada kelas berasid dan beralkali serta menetapkan bahawa setiap kelas mewarnakan bahagian sel yang berbeza. Pada 1880 dia mencampurkan kedua-duanya: larutan tepu metilena biru dituangkan ke dalam fuksin berasid sehingga supernatan menjadi jernih. Hasilnya, yang dipanggilnya neutralen Farbkörper atau pewarna neutral, menghasilkan tiga warna dan bukannya satu, mendedahkan granul dalam sel polimorfonuklear yang sebelum itu tidak kelihatan, dan membolehkan kiraan pembezaan leukosit pertama dilakukan. Oleh sebab granul tersebut menyerap kedua-dua komponen campuran, Ehrlich mencipta istilah neutrofil untuk sel yang membawanya.

Dua tahun kemudian Koch menggunakan metilena biru untuk menemukan basil tuberkel, dan pada 1883 Ehrlich memperbaik kaedah itu. Pada 1886 dia menerbitkan pemerhatian yang berbeza: dia menyuntik pewarna itu ke dalam haiwan hidup dan membandingkan tahap penyerapannya oleh setiap organ, lalu menyimpulkan bahawa pewarna tersebut mempunyai afiniti yang ketara terhadap tisu otak dan saraf. Dia mengaitkan afiniti itu dengan kitaran pengoksidaan-penurunan pewarna tersebut, yang telah diperhatikannya pada tahun sebelumnya. Kitaran itu juga menjadi sebab larutan metilena biru kehilangan warnanya apabila oksigennya habis dan mendapatkannya kembali apabila udara kembali. Eksperimen yang mula-mula mengukur akibat kitaran tersebut berlaku pada dekad kemudian, dan mekanismenya sendiri ialah subjek yang berasingan daripada sejarahnya.

Parasit dan nukleus ungu

Alphonse Laveran menemukan parasit malaria pada 1880 dengan memeriksa darah segar yang tidak diwarnakan. Untuk melihatnya secara rutin dalam sapuan kering memerlukan pewarna, dan pewarna pada zaman itu hanya menghasilkan warna merah dan biru.

Pada 1888 ahli patologi Poland Czesław Cheçinski menggantikan fuksin berasid dengan eosin, menghasilkan campuran metilena biru dan eosin. Kes yang menjadi asas kaedahnya melibatkan seorang askar yang meninggal dunia akibat malaria pada 30 September 1887. Dalam filem darah, Cheçinski melihat bentuk biru seperti bunga daisi, yang kini dikenal pasti sebagai Plasmodium malariae, dan bentuk seperti sabit, yang kini dikenal pasti sebagai gametosit Plasmodium falciparum. Hasil itu menamatkan dua penjelasan yang bersaing tentang penyakit tersebut serentak: teori miasma, dan dakwaan oleh Edwin Klebs dan Corrado Tommasi-Crudeli bahawa malaria disebabkan oleh bakteria.

Parasit itu dapat dilihat. Nukleusnya tidak, menyebabkan sifat sebenarnya masih belum jelas. Ernst Malachowski, seorang doktor di Breslau, menyelesaikan masalah itu secara tidak sengaja dan kemudian secara sengaja. Dia menyedari pewarnaan berbeza pada nukleus plasmodium dalam satu penyediaan pada 1889 tetapi tidak dapat menghasilkannya semula. Mengasidkan metilena biru tidak membantu. Mengalkalikannya dengan boraks menghasilkan kesan tersebut setiap kali. Dia menunjukkan teknik itu secara terbuka pada 15 Jun 1890 dan menerbitkannya pada tahun yang sama, dengan kaedah yang lebih lengkap pada Ogos 1891.

Dmitri Romanowsky menerbitkan versinya sendiri pada September 1891. Hasil terbaiknya datang daripada sebotol larutan metilena biru yang terabai dan berkulat, berusia lebih daripada dua bulan. Catatan Malachowski bersifat disengajakan dan, menurut kata-katanya, mudah dihasilkan semula; catatan Romanowsky ialah jalan buntu yang hanya berjaya sekali. Namun, eponim itu tetap diberikan kepada Romanowsky, dan pertikaian tentang siapa yang menghasilkan warna ungu yang menjadikan nukleus kelihatan ialah kisah berasingan dengan dokumennya sendiri.

Rajah: carta suhu kedua daripada laporan Guttmann dan Ehrlich pada 1891. Panel atas merangkumi 13 hingga 24 Julai dan panel bawah 25 Julai hingga 5 Ogos; catatan pada margin menyatakan dos yang diberikan, dan suhu kekal hampir normal selama tiga minggu terakhir rekod tersebut. Dihasilkan semula daripada laporan yang diimbas untuk Krafts, Hempelmann dan Skórska-Stania, Parasitology Research 111:1–6 (2012), PMID 22411634.

Pematangan rupa-rupanya ialah demetilasi

Tiada sesiapa yang terlibat pada 1890-an mengetahui apa yang dilakukan oleh "pematangan" terhadap metilena biru. Jawapannya muncul daripada kimia industri. Heinrich August Bernthsen telah mensintesis sebatian induk fenotiazina pada 1883, menetapkan pada 1885 bahawa metilena biru tergolong dalam keluarga itu, dan menunjukkan dalam tempoh yang sama bahawa keadaan beralkali menyingkirkan kumpulan metil daripada pewarna tersebut, menghasilkan sebatian yang kini dipanggil azure.

Bernard Nocht mengekstrak pecahan aktif pada 1898 dan 1899 dan hanya dapat menamakannya Rot aus Methylenblau, merah daripada metilena biru. Michaelis mengenal pastinya sebagai azure I pada 1901. Jenner memperkenalkan metanol mutlak sebagai pelarut bagi mendakan pewarna pada 1899, yang menghapuskan keperluan untuk menetapkan filem darah dengan haba; Leishman dan Reuter menggabungkan kedua-dua kemajuan tersebut; Wright menerbitkan kaedah yang dipermudah pada 1902. Sumbangan Giemsa, juga pada 1902, ialah berhenti bergantung pada larutan yang matang secara rawak dan sebaliknya menggunakan kuantiti terukur pewarna yang diketahui. Dia kemudian enggan menerbitkan cara dia menghasilkan methylene azure tulen dan menjual kaedah tersebut kepada makmal Dr. Grübler, yang memasarkan produk itu sebagai azure I dan mendakwa bahawa hanya versinya ialah pewarna Giemsa yang tulen.

Dua perang dunia secara tidak sengaja menyelesaikan proses itu. Apabila pewarna Jerman tidak lagi boleh diperoleh, Lillie, Roe dan Wilcox mengkaji bahan pengganti Amerika dan mendapati bahawa pewarnaan terbaik datang daripada tiga komponen yang dipisahkan: metilena biru tulen, produk penguraiannya azure B, dan eosin. Ketiga-tiganya kekal sebagai komponen utama pewarna yang digunakan untuk mendiagnosis malaria hari ini, di bawah nama yang kini menggabungkan Malachowski, Wright dan Giemsa.

Rajah: bentuk cincin Plasmodium falciparum dalam sel merah manusia, diwarnakan dengan kaedah jenis Romanowsky. Struktur ungu di dalam cincin ialah kromatin yang buat pertama kalinya dapat dilihat melalui metilena biru Malachowski yang dirawat dengan boraks. Imej oleh Ernst Hempelmann, dilepaskan ke domain awam.

Satu nama, beberapa bahan

Tahun-tahun yang diperlukan untuk memisahkan komponen-komponen itu meninggalkan masalah yang bertahan lebih lama daripada kimianya. Ralph Lillie membezakan pada 1969 antara pewarna biologi, yang "dihasilkan mengikut spesifikasi ketat yang setimpal dengan kegunaannya yang halus dan menuntut ketepatan", dengan pewarna bukan biologi untuk mewarnakan tekstil, yang "memerlukan piawaian pembuatan yang kurang ketat dan kurang menuntut". Kedua-dua jenis produk menggunakan nama yang sama, dan perbezaan antara keduanya tidak pernah sekadar perbezaan darjah. Spesifikasi yang ditulis untuk kapas dan spesifikasi yang ditulis untuk reagen diagnostik tidak boleh saling menggantikan, dan bahan yang dibuat mengikut spesifikasi tekstil tidak dimaksudkan untuk ditelan.

Azure B ialah gambaran paling jelas. Ia merupakan bentuk monodemetilasi metilena biru, mempunyai aktiviti farmakologi yang boleh diukur tersendiri, dan hadir sebagai komponen tidak terkawal dalam penyediaan klinikal metilena biru selama lebih daripada satu abad sebelum kedua-duanya dipisahkan. Satu kumpulan mendapati bahawa tisu manusia yang diambil sampel semasa autopsi selepas pemberian metilena biru mengandungi 5 hingga 14 peratus metilena biru yang tidak berubah dan 86 hingga 95 peratus azure B. Sama ada sesuatu penyediaan patut mengandungi azure B, dan pada had berapa, ialah persoalan spesifikasi, dan penyelidikan mengenai azure B sebagai bendasing dan metabolit meneruskan persoalan itu dari situ.

Spesifikasi juga menentukan akibat praktikalnya. Pematuhan USP ialah laluan kepada ketulenan tertinggi yang ditawarkan pasaran, kerana ia merupakan piawaian ujian diterbitkan yang lengkap dan bukannya satu pengukuran tunggal. Ia merangkumi identiti, asai, bendasing organik termasuk pewarna azure, pelarut baki, bendasing unsur, sisa selepas pembakaran, had mikrob, dan endotoksin bakteria. Sijil yang melaporkan keputusan logam berat dan menyebutnya sebagai pematuhan USP hanya melaporkan satu baris daripada senarai itu.

Blupreme mendapatkan metilena birunya daripada pengeluar farmaseutikal dan menerbitkan sijil analisis penuh, dengan menguji keseluruhan spesifikasi USP dan bukannya logam berat sahaja. Panduan membaca sijil analisis dan perkara yang ditetapkan dan tidak ditetapkan oleh penetapan USP menerangkan cara menyemak dokumen itu berbanding dakwaannya.

Apa yang dibenarkan oleh sejarah, dan apa yang tidak

Jalur sejarahnya nyata, dan lebih panjang daripada yang digambarkan oleh kebanyakan halaman produk. Metilena biru digunakan untuk merawat malaria pada 1891, dilaporkan sebagai sedatif dalam psikosis teragitasi pada 1899, dan rantai sisinya berkaitan dengan quinacrine, chloroquine, promethazine dan chlorpromazine. Makalah Ehrlich pada 1890 bersama Arthur Leppmann menerangkan kelegaan sakit neuralgik dan reumatik, kemudian mempertimbangkan tetapi memilih untuk tidak menguji pewarna tersebut dalam penyakit mental.

Tiada satu pun daripada perkara itu menetapkan penggunaan moden. Hasil malaria pada 1891 melibatkan dua pesakit dan sebuah carta suhu. Pengalaman lama dengan sesuatu molekul ialah sebab untuk mengkajinya, bukannya suatu hasil. Sejarah sebatian itu sebagai ubat dan ujian moden dalam malaria menjawab soalan yang berbeza daripada yang ditanyakan Ehrlich, dan titik akhir perlu dinilai berdasarkan istilahnya sendiri.

Terdapat satu butiran dalam rekod yang lebih berkaitan dengan masa kini daripada masa lalu. Apabila penyelidik menjalankan ujian malaria metilena biru di Burkina Faso pada 2000-an, mereka mendapati diri mereka bersaing untuk mendapatkan bahan gred farmaseutikal, dan melaporkan bahawa harga bahan mentah telah meningkat kira-kira seratus kali ganda setelah bahan itu mempunyai pengesahan GMP. Pewarna boleh digantikan. Ubat tidak boleh. Perbezaan yang dibuat Lillie pada 1969 ialah perbezaan yang sama yang menentukan kandungan sesebuah botol hari ini. :::