Eksperimentai, susieję metileno mėlynąjį su ląsteliniu kvėpavimu

Defibrinuotas žmogaus kraujas, tris valandas laikomas 37 °C temperatūroje, suvartoja apie du procentus jame esančio deguonies. Prieš inkubaciją pridėjus nedidelį kiekį metileno mėlynojo, tas pats kraujas suvartoja apie šešiasdešimt penkis procentus. Pačios ląstelės nepasikeitė. Pasikeitė tik tirpalas.

Šis skaičius pateiktas 1928 m. Johnso Hopkinso universitete dirbusių George'o Harropo ir E. S. Guzmano Barrono straipsnyje. Iš jo kilo plačiai kartojamas teiginys, kad metileno mėlynasis gerina ląstelinį kvėpavimą. Teiginys nėra klaidingas, tačiau jo prasmė siauresnė, nei gali pasirodyti.

Ką iš tikrųjų rodo lentelėje pateiktas skaičius

Vertintas rodiklis buvo deguonies suvartojimas, nustatytas dujų analize. Harropas ir Barronas šviežiai paimtą kraują filtravo per vatą 10 °C temperatūroje, kad pašalintų leukocitus, prisotino mėginį deguonimi, padalijo jį, į vieną dalį pridėjo dažiklio ir po inkubacijos išanalizavo abi dalis. Leukocitų skaičius retai viršydavo maždaug tūkstantį kubiniame milimetre. Deguonies suvartojimas buvo pateikiamas kaip išnykusi pradinio mėginio deguonies kiekio dalis.

Jie taip pat matavo anglies dioksidą, tačiau čia metodas sukėlė sunkumų. Per pirmą inkubacijos valandą defibrinuotas kraujas išskyrė iki dviejų milimolių anglies dioksido 100 mL dėl priežasčių, nesusijusių su tiriama reakcija, todėl viso kraujo kvėpavimo koeficientai buvo netinkami naudoti. Tik nuplautos ląstelės Locke'o tirpale davė interpretuojamus rezultatus, kurie tiek su dažikliu, tiek be jo telkėsi tarp 0.73 ir 0.80.

Tai nėra nereikšminga detalė. Šiuose straipsniuose „kvėpavimas“ reiškia dujų apykaitą uždarame inde. Skirtumas tarp deguonies suvartojimo ir naudingosios energijos gamybos atskirai nagrinėjamas straipsnyje apie tai, ką deguonies suvartojimas pasako ir ko nepasako apie ATP.

Dažiklis labiausiai padidino kvėpavimą ten, kur ląstelės kvėpavo mažiausiai

Subrendusių žinduolių eritrocitų deguonies suvartojimas beveik neišmatuojamas. Branduolį turinčių paukščių eritrocitų – išmatuojamas. Harropas ir Barronas tyrė abejus, ir šis skirtumas tapo jų argumentacijos pagrindu.

Žinduolių mėginiuose dažiklis padidino deguonies suvartojimą nuo dvidešimties iki penkiasdešimties kartų. Žąsų kraujyje, kurio ląstelės jau kvėpavo, suvartojimo greitis niekada nepadidėjo daugiau nei dvigubai. Kuo didesnis buvo pradinis kvėpavimas, tuo mažiau dažiklis galėjo jį padidinti.

Tokia pati tendencija matoma ir vienos rūšies viduje. Žmogaus, sergančio tikrąja policitemija, mėginys, kuriame buvo nesubrendusių ląstelių, be dažiklio suvartojo 11.3 procento savo deguonies, o nuplautos sveiko donoro ląstelės – 2.8 procento. Dažiklis šį rodiklį padidino tik iki 63.4 procento: suvartojimas paspartėjo šešis kartus, nors normaliose ląstelėse jis paspartėjo beveik trisdešimt kartų. Dažiklis priartino subrendusių ląstelių elgseną prie nesubrendusių ląstelių elgsenos – būtent taip jo veikimą aiškino autoriai.

Cianidas turėjo tai sustabdyti

Buvo žinoma, kad cianidas sustabdo ląstelinę oksidaciją. Harropas ir Barronas vis tiek pridėjo jo kartu su dažikliu.

Galvijų kraujo rezultatai yra tipiški. Be jokių priedų deguonies kiekis per tris valandas sumažėjo nuo 22.61 iki 22.03 tūrio procento. Su metileno mėlynuoju jis sumažėjo iki 12.84. Su metileno mėlynuoju ir vienos penkiatūkstantosios molio litre koncentracijos kalio cianidu jis sumažėjo iki 12.74. Dažiklio poveikis iš esmės nepakito.

Paveikslas: nepertraukiamas žmogaus eritrocitų mikrokvėpavimo įrašas. Rodyklė žymi metileno mėlynojo pridėjimą. Iki tol kreivė beveik horizontali; vėliau ji tolygiai kyla. Atkurta iš Harrop ir Barron, Journal of Experimental Medicine 48:207–223 (1928), PMID 19869478.

Jie padarė išvadą, kad dažiklis veikė kaip deguonies nešiklis, „suteikdamas medžiagą, kuri išnyko iš suaugusių žinduolių branduolio neturinčių eritrocitų“. Po dvejų metų Rockefellerio institute dirbę Michaelisas ir Salomonas šį nesutarimą suformulavo taip, kaip jis išliko iki šiol. Arba dažiklio poveikis buvo „atsitiktinė dažiklio savybė“, arba dažiklis buvo „kokios nors nežinomos organizmuose esančios medžiagos modelis“. Ši alternatyva vis dar neišspręsta. Pasikeitė tai, kad dabar ląsteles galima apibūdinti kur kas tiksliau.

Kepenų ekstraktas veikė taip pat

Michaelisas ir Salomonas parodė, kad organų ekstraktai, paruošti šaltu vandeniu, sukelia tokį patį stimuliavimą. Stipriausiai veikė žiurkių kepenų ekstraktas, po jo – inkstų, blužnies ir sėklidžių. Smegenų, raumenų ir kraujo serumo poveikis buvo menkas arba jo visai nebuvo.

Tada jie patikrino ekstrakto poveikį esant anglies monoksidui. Nei ekstrakto, nei dažiklio sukeltas kvėpavimas nepakito mišinyje, kuriame buvo 98 procentai anglies monoksido ir 2 procentai deguonies. Tas pats dujų mišinys slopino mielių ir branduolį turinčių vištų eritrocitų kvėpavimą maždaug 60–80 procentų, kaip ir numatė Warburgo aprašytas anglies monoksidui jautrus kvėpavimo fermentas. Taigi nenustatyta audinių medžiaga nebuvo Warburgo fermentas.

Tyrimo eigoje buvo atmestos kelios galimos medžiagos. Redukuotas glutationas ir cisteinas sukėlė tik tokį deguonies suvartojimą, kokio reikėjo jų pačių oksidacijai. Hardeno ir Youngo kofermentas buvo atmestas, nes daugiausia jo yra raumenyse, o jų ekstraktas veikė beveik silpniausiai. Prieš kelerius metus įvardytas Keilino citochromas susidūrė su tuo pačiu prieštaravimu. Savo mintį, kad veiklioji medžiaga kilo iš ląstelės branduolio, autoriai vadino tik prielaida.

Poveikiui reikėjo tam tikrų sąlygų

Ląstelės turėjo būti nepažeistos. Distiliuoto vandens ar pakartotinio užšaldymo sukelta hemolizė panaikino atsaką tiek į dažiklį, tiek į ekstraktą, o dalinė hemolizė jį proporcingai sumažino.

Taip pat reikėjo cukraus. Gliukozė, fruktozė ir sacharozė palaikė dažiklio sukeltą kvėpavimą; manitolis – ne. Nesant cukraus, kvėpavimo visai nebuvo, ir atrodė, kad dažiklis tuo metu pažeidžia ląsteles, todėl po vienos ar dviejų valandų pridėta gliukozė jo neatkūrė. Autoriai manė, kad dažiklis oksidavo ląstelei būtiną struktūrinį komponentą.

Apšvietimas gerokai padidino dažiklio poveikį, nors poveikis buvo aiškus ir tamsoje. Kiti redukuojami dažikliai veikė kitaip: toluileno mėlynasis prilygo metileno mėlynajam arba jį pranoko, o indigo disulfonatas beveik nieko nepakeitė. Aiškaus ryšio tarp dažiklio oksidacijos–redukcijos potencialo ir jo poveikio dydžio nenustatyta; autoriai tai aiškino membranos pralaidumu ir toksiškumu.

Poveikis siejosi su fermentacija, o ne kvėpavimu

1930 m. Barrono tyrime nuo ląstelių suspensijų pereita prie normalių žiurkių organų ir transplantuotų navikų audinių pjūvių.

Audiniuose, kuriuose nevyko aerobinė glikolizė, metileno mėlynasis nieko nepakeitė arba šiek tiek slopino deguonies suvartojimą: inkstuose maždaug 14 procentų, kasoje maždaug 14 procentų, kepenyse maždaug 5 procentais. Audiniuose, kuriuose fermentacija vyksta esant deguoniui, jis padidino suvartojimą: blužnyje maždaug 8 procentais, smegenyse maždaug 13 procentų. Navikuose padidėjimas siekė nuo maždaug 27 procentų žmogaus krūties karcinomoje iki daugiau nei 80 procentų Rouso vištų sarkomoje ir buvo apytikriai proporcingas kiekvieno audinio aerobinei glikolizei.

Paveikslas: kiekvienas taškas žymi vieną audinio tipą. Horizontaliojoje ašyje pateikta aerobinė glikolizė; vertikaliojoje – deguonies suvartojimo pokytis pridėjus metileno mėlynojo. Duomenys iš Barron, Journal of Experimental Medicine 52:447–456 (1930), 6 lentelės, PMID 19869777.

Eksperimentas su cianidu parodė priešingą vaizdą. Kai šių anksčiau nereagavusių audinių kvėpavimas buvo užblokuotas cianidu ir išryškėjo fermentacija, dažiklis vėl padidino deguonies suvartojimą: inkstuose maždaug 59 procentais, kepenyse maždaug 19 procentų, blužnyje maždaug 286 procentais, sėklidėse maždaug 200 procentų.

Barronas pasiūlė dažiklį naudoti kaip ląstelės ar audinio fermentacinio pajėgumo testą ir straipsnį užbaigė spėjimu: daug naviko kultūros kartų auginant terpėje su dažikliu, galbūt vieną dieną naviko medžiagų apykaita galėtų visam laikui tapti panaši į normalaus audinio. Tai buvo 1930 m. iškeltas tyrimo klausimas. Tai nėra teiginys apie gydymą.

Ko šie eksperimentai negalėjo matuoti

1928 ir 1930 m. „kvėpavimas“ reiškė deguonies suvartojimą. Apie adenozino trifosfatą pirmą kartą pranešta 1929 m., o tai, kad izoliuotos mitochondrijos esterifikuoja fosfatą pernešdamos elektronus, pademonstruota 1949 m. Nė viename ankstyvajame straipsnyje apie metileno mėlynąjį negalėjo būti matuojama energijos gamyba, ir nė viename nebuvo teigiama, kad ji matuota.

Antra problema – pačios ląstelės. Subrendę žinduolių eritrocitai neturi mitochondrijų. Retikulocitų stadijoje jie pašalina mitochondrijas ir ribosomas selektyvios autofagijos būdu, todėl subrendęs eritrocitas energiją gauna iš glikolizės, o pentozės fosfatų kelias jam svarbus daugiausia dėl NADPH, ne dėl ATP. 1928 m. eksperimentuose nebuvo elektronų pernašos grandinės, kurią būtų galima pataisyti. Kad ir kas vartojo deguonį, tai darė ką nors kita.

Kas tai buvo, dabar aprašyta gana gerai. Metileno mėlynasis priima elektronus iš ląstelės redukuojančių ekvivalentų ir tampa leukometileno mėlynuoju, kurį molekulinis deguonis vėl oksiduoja, užbaigdamas ciklą. Žmogaus eritrocituose redukcijos etapą vykdo nuo NADPH priklausoma flavino reduktazė ir giminingos disulfidų reduktazės. 1976 m. tyrime, kuriame naudota žymėta gliukozė, nustatyta, kad dažiklis stimuliuoja heksozių monofosfato šuntą, kad mažos koncentracijos poveikis priklauso nuo oksihemoglobino, o didesnė koncentracija, 0.1 mM, sukelia vandenilio peroksido susidarymą. Redukuotam dažikliui susidūrus su deguonimi, susidaro peroksidas, o ne fosfatiniai ryšiai.

Mitochondrijose vaizdas prieštaringesnis, nei pripažįstama populiariose santraukose. Viena tyrimų kryptis teigia, kad dažiklis paima elektronus iš I komplekso srities ir perduoda juos citochromui c. Kituose tyrimuose nustatyta, kad pelių smegenų mitochondrijose jis negali atkurti kvėpavimo po blokavimo antimicinu, o elektronų akceptorius susietas su III komplekso ubichinolio prisijungimo vieta. Trečiuose nustatyta, kad mažos koncentracijos padidina deguonies suvartojimą ramybės būsenoje, bet nepakeičia ADP stimuliuojamo kvėpavimo. Esmę tiesiausiai nusako tai, kad metileno mėlynojo sukeltas deguonies suvartojimas visiškai nepriklauso nuo oksidacinio fosforilinimo: jis išliko slopinant kvėpavimo grandinę ir preparatuose, kuriuose jos nebuvo.

Yra ir tiesioginių skirtumo tarp šių dviejų rodiklių matavimų. Izoliuotose žiurkių kepenų mitochondrijose didėjančios dažiklio koncentracijos mažino kvėpavimo kontrolės santykius ir sukėlė brinkimą, kurį autoriai apibūdino kaip oksidacinio fosforilinimo atsiejimą. Perfuzuojamose žiurkių kepenyse metileno mėlynasis didino deguonies suvartojimą, o ATP ir ADP santykis mažėjo.

Klinikiniai duomenys rodo tą patį. Methemoglobinemija gydoma į veną skiriant maždaug nuo vieno iki dviejų miligramų metileno mėlynojo kilogramui kūno masės, veikiant nuo NADPH priklausomam redukcijos keliui, o didesnės dozės sukelia tą pačią būklę, kuri gydoma. Toje pačioje apžvalgoje pažymima, kad priešnuodžio poveikis stipriausias nepažeistuose eritrocituose ir susilpnėja esant hemolizei – tai 1930 m. hemolizės tyrimo išvada, po septyniasdešimt trejų metų vėl pasirodžiusi ligoninės kontekste. Junginio, kurio naudingą ir žalingą poveikį skiria dozės slenkstis, dozės negalima nustatyti pagal deguonies suvartojimo matavimą.

Kodėl aptariant tai svarbi ir partija

Harropas ir Barronas pastebėjo kai ką, ką verta perskaityti dar kartą. Pats metileno mėlynasis spektroskope sukuria juostą tarp dviejų methemoglobinui būdingų juostų, „o tai paviršutiniškai apžiūrint gali lengvai suklaidinti“. Dažiklis gali imituoti ieškomą medžiagą.

Ta pati problema turi ir cheminę išraišką. Giminingas fenotiazinas, esantis kaip nedidelė sudedamoji dalis, pasižymi sava oksidacijos–redukcijos elgsena, savu pralaidumu ir savu toksiškumu. Vienas dokumentuotas atvejis aiškiai parodo, kodėl tai svarbu: metileno mėlynojo jodinimo tyrime mėginiai, kuriuose buvo maždaug 7–8 procentai Azure B, daugiausia sudarė jodintą Azure B, todėl reakcijoje dominavo priemaiša, o ne metileno mėlynasis.

Kiekvienas, naudojantis metileno mėlynąjį kaip reagentą laboratorijoje, dažymo darbo vietoje ar akvariume, dirba su neapibrėžtos sudėties medžiaga, jei partija nėra ištirta. Giminingos medžiagos, tapatybė, elementinės priemaišos, tirpiklių likučiai ir kaitinimo liekana yra eksperimento dalis, o ne vien jį lydintys dokumentai. Blupreme metileno mėlynąjį įsigyja iš farmacijos gamintojo ir skelbia išsamų analizės sertifikatą, tikrindama pagal visą USP specifikaciją, o ne vien sunkiuosius metalus; analizės sertifikato skaitymo vadove ir straipsnyje apie tai, ką patvirtina ir ko nepatvirtina USP kokybės žymėjimas, paaiškinama, kaip patikrinti, ar dokumentas pagrindžia teiginį.

Skaičius buvo teisingas

1928 ir 1930 m. eksperimentai buvo kruopštūs, ir pagrindinis jų pastebėjimas išliko: redukuojamas dažiklis gali priversti beveik nekvėpuojančią ląstelę vartoti deguonį daug kartų greičiau nei ramybės būsenoje, apeidamas etapą, kurį blokuoja cianidas.

Klaida atsiranda vėliau, kai „kvėpavimas“ suprantamas šiuolaikine prasme. Dujų apykaitos matavimas rodo, kad elektronai pasiekė deguonį. Jis neparodo, kad bent dalis jų buvo panaudota ATP gaminti, o mitochondrijų neturinčioje ląstelėje skirtumas tarp šių dviejų teiginių yra didžiausias, koks tik gali būti. Platesnis metileno mėlynojo veikimo ląstelėse žemėlapis šį skirtumą pateikia platesniame kontekste, o junginio istorija nuo dažiklio iki vaisto paaiškina, kaip tekstilės dažiklis apskritai pateko į šiuos eksperimentus.