Articolo
Terapia fotodinamica con blu di metilene: come viene studiato il trattamento
La terapia fotodinamica con blu di metilene sembra consistere in due passaggi: applicare un colorante blu e illuminare con luce rossa. Questo modello mentale è sbagliato ed è all'origine di gran parte della confusione su questo trattamento. La procedura studiata comprende tre componenti che devono essere presenti nello stesso luogo e nello stesso momento: il fotosensibilizzante nella sua forma capace di assorbire la luce, fotoni di una lunghezza d'onda adeguata a una dose misurata e ossigeno molecolare che riceva l'energia trasferita. Se si elimina uno qualsiasi di questi componenti, l'effetto dichiarato non ha un meccanismo che lo sostenga.
Questo articolo spiega come i ricercatori descrivono tale sistema a tre componenti, quali parametri controllano e perché una lunghezza d'onda e un valore di energia pubblicati non possono essere convertiti in una procedura domestica. Gli esiti oncologici sono trattati in una rassegna sul blu di metilene e la ricerca sul cancro separata, mentre le applicazioni odontoiatriche sono raccolte nella ricerca fotodinamica orale e odontoiatrica. Nessuno dei due argomenti viene riproposto qui.
Il colorante è un fotosensibilizzante, non un semplice mezzo di colorazione
Il blu di metilene assorbe intensamente la luce rossa, con il picco del monomero vicino a 664–666 nm e un'assorbività molare molto elevata. Questa banda di assorbimento spiega perché gli studi sulla terapia fotodinamica con blu di metilene utilizzano sorgenti rosse, in genere nell'intervallo di circa 630–680 nm. Una lampada che emette al di fuori di questa banda può apparire luminosa pur fornendo un'eccitazione utilizzabile quasi nulla. I criteri relativi alla lunghezza d'onda alla base di questa scelta sono spiegati in come il blu di metilene assorbe la luce rossa.
L'assorbimento è soltanto il primo passaggio. Il colorante eccitato passa a uno stato di tripletto più duraturo, dal quale sono possibili due percorsi fotochimici. Nella chimica di tipo I, il colorante eccitato scambia elettroni o atomi di idrogeno con i substrati vicini e produce radicali, con successive reazioni che coinvolgono il superossido. Nella chimica di tipo II, il colorante allo stato di tripletto trasferisce energia direttamente all'ossigeno nello stato fondamentale e produce ossigeno singoletto. In condizioni ossigenate, il blu di metilene agisce prevalentemente come sensibilizzante per la produzione di ossigeno singoletto, con una resa quantica riportata vicina a 0.5 in acqua, mentre il contributo delle reazioni di tipo I aumenta o diminuisce in base all'ambiente locale. La rassegna del 1993 sulla fotochimica del blu di metilene con substrati biologici descrive entrambi i percorsi e mostra perché il loro equilibrio non può essere dedotto dall'etichetta del colorante.
La stessa rassegna identifica il principale bersaglio tra gli acidi nucleici. La guanina ha il potenziale di ossidazione più basso tra le basi del DNA, quindi l'ossigeno singoletto la ossida preferenzialmente, formando prodotti come la 8-osso-deossiguanosina. Per questo danno non è necessaria l'intercalazione nel DNA. La rassegna avverte però anche di non considerare il DNA come l'unico elemento rilevante. Il blu di metilene ossida proteine, lipidi e membrane, e il bersaglio letale in un dato esperimento dipende da dove si localizza il colorante. La concentrazione nella soluzione che circonda il campione è quindi un indicatore poco affidabile della dose al bersaglio. Chi confronta questa chimica indotta dalla luce con i ruoli redox del colorante al buio dovrebbe mantenerli distinti, come spiegato nella trattazione di come il blu di metilene agisce nelle cellule.
Un composto capostipite, non un farmaco ottimizzato
La seconda fonte di riferimento è la rassegna del 2005 sullo sviluppo dei fotosensibilizzanti fenotiazinici, che considera il blu di metilene una struttura di partenza con limiti noti, anziché un fotosensibilizzante già perfezionato. Piccole modifiche strutturali alterano la lipofilia, l'assorbimento cellulare, la localizzazione intracellulare, la produzione di ossigeno singoletto, la tossicità al buio e la resistenza alla riduzione. La metilazione del cromoforo, per esempio, aumenta la lipofilia e la generazione di ossigeno singoletto e rallenta la riduzione alla forma leuco inattiva; negli studi alla base della rassegna, gli analoghi metilati mostravano una fototossicità maggiore a circa 7.2 J per cm quadrato. Una maggiore lipofilia non è comunque automaticamente migliore, perché un'idrofobicità eccessiva compromette la solubilità, favorisce l'aggregazione e può alterare la geometria necessaria alla fotochimica.
La questione della forma leuco merita attenzione perché è invisibile. Il blu di metilene ossidato è blu e assorbe la luce rossa. Il leuco-blu di metilene ridotto è quasi incolore e assorbe poco nella stessa banda; il colorante ridotto all'interno delle cellule o nei tessuti scarsamente ossigenati è quindi temporaneamente escluso dalla frazione fotoattiva fino alla riossidazione. Lo stato redox del tessuto modifica pertanto la concentrazione effettiva del fotosensibilizzante anche quando la concentrazione applicata è fissa. La storia delle formulazioni, compresi i primi usi clinici e di laboratorio di questa famiglia di coloranti, è trattata nella storia del blu di metilene in medicina.
La tabella degli studi: cosa varia e cosa significa
La tabella seguente è lo strumento di confronto originale di questo articolo. Ogni riga rappresenta una variabile del trattamento che gli studi devono riportare. Leggendola da sinistra a destra si comprende perché modificare un'impostazione cambia il significato di tutte le altre.
| Variabile | Cosa riportano gli studi | Perché modifica l'esito |
|---|---|---|
| Formulazione del fotosensibilizzante | Colorante libero in acqua, soluzione salina o tampone; veicoli a base di etanolo e Cremophor negli studi animali; liposomi, particelle polimeriche o veicoli a base di ciclodestrine negli studi sperimentali | Il veicolo e il sistema di trasporto modificano l'assorbimento, la localizzazione e la penetrazione attraverso barriere come la matrice del biofilm o il tessuto tumorale |
| Concentrazione applicata | Gli studi antimicrobici sull'uomo riportano circa 0.0003–0.06 M con intervalli tra applicazione del composto e illuminazione di 1–5 minuti; gli studi sui tumori animali includono esempi vicini a 500 microgrammi per mL per via intratumorale | Una concentrazione complessiva più elevata può aumentare la dimerizzazione associata all'assorbimento vicino a 590 nm e ridurre la fotochimica produttiva del monomero, quindi raddoppiare la concentrazione non significa necessariamente raddoppiare l'effetto |
| Intervallo tra applicazione del composto e illuminazione | Minuti nei protocolli antimicrobici topici; più lungo e dipendente dal veicolo nei modelli tumorali | L'intervallo determina dove si trova il colorante quando arriva la luce, stabilendo così il bersaglio biologico dominante |
| Lunghezza d'onda | In genere circa 630–680 nm | Deve sovrapporsi alla banda di assorbimento del monomero; le soluzioni ricche di dimeri modificano l'assorbimento effettivo |
| Irradianza | Gli studi antimicrobici sull'uomo riportano circa 50–750 mW per cm quadrato; gli studi sulle ferite negli animali utilizzano comunemente valori pari o inferiori a 100 mW per cm quadrato | Un'irradianza elevata può consumare l'ossigeno locale più rapidamente di quanto la perfusione lo reintegri, riducendo l'efficienza a parità di fluenza nominale |
| Fluenza | Gli studi antimicrobici sull'uomo riportano circa 6–18 J per cm quadrato nell'arco di 8 secondi–10 minuti; gli studi sulle ferite negli animali riportano circa 12–360 J per cm quadrato | L'energia totale senza irradianza, tempo e geometria è una dose incompleta |
| Ossigenazione | Raramente controllata direttamente; dedotta dal tipo di tessuto, dal tasso di fluenza e dal frazionamento | La chimica di tipo II consuma ossigeno, quindi impostazioni luminose identiche possono produrre effetti diversi in bersagli ben perfusi rispetto a quelli ipossici |
| Bersaglio e contesto | Modelli di infezione cutanea e delle ferite, modelli di biofilm orale, sistemi di carcinoma e melanoma in coltura, tumori murini, segnalazioni storiche sui tumori cutanei | Geometria, profondità, proprietà ottiche e danno tollerato dall'ospite differiscono così tanto che i valori antimicrobici non sono mai trasferibili quantitativamente agli studi sui tumori |
Gli intervalli sopra riportati sono quelli osservati negli studi, non un protocollo raccomandato. Questa distinzione è lo scopo della tabella. L'ampiezza delle dosi luminose riportate è di per sé un'indicazione del fatto che non esiste una dose di luce per il blu di metilene trasferibile tra contesti. Il contesto di laboratorio relativo agli studi sui biofilm attivati dalla luce è presentato in blu di metilene contro i biofilm, mentre un quadro più ampio sulla terapia cutanea e luminosa si trova nella trattazione dei fondamenti della fotosensibilità cutanea e della dose di luce.
Perché valori energetici identici possono produrre effetti biologici diversi
Quando i parametri pubblicati vengono citati senza il loro contesto, ricorrono quattro equivoci.
Primo, la fluenza non è la dose. Due esposizioni alla stessa lunghezza d'onda e con gli stessi J per cm quadrato differiscono se una viene erogata rapidamente e l'altra lentamente, perché il consumo di ossigeno, la riparazione durante l'esposizione e il fotosbiancamento del colorante dipendono tutti dalla velocità e dal tempo. Riportare l'energia senza irradianza e durata dell'esposizione lascia l'esperimento descritto in modo insufficiente.
Secondo, le proprietà ottiche del tessuto modificano ciò che arriva dalla lampada. Assorbimento, diffusione, geometria della superficie e retrodiffusione fanno sì che la fluenza all'interno del tessuto possa differire sensibilmente dal valore misurato all'apertura della lampada, in alcune circostanze di fattori prossimi a due secondo la letteratura sulla dosimetria clinica. Un valore copiato da un articolo descrive la geometria di quell'articolo, non tutte le geometrie.
Terzo, la localizzazione determina il bersaglio. Un colorante cationico si distribuisce nelle membrane, nei mitocondri, nei lisosomi, negli involucri batterici o nella matrice extracellulare in base alla formulazione, alla carica, alla lipofilia, all'intervallo e al tessuto. La rassegna del 1993 sulla fotochimica documenta danni ad acidi nucleici, proteine, lipidi, membrane, organelli, virus, batteri, cellule di mammifero e sistemi tumorali: proprio per questo la stessa combinazione di colorante e luce può uccidere attraverso percorsi diversi in contesti sperimentali diversi.
Quarto, l'ossigeno si consuma. Tassi di fluenza elevati possono superare la velocità di reintegro tramite diffusione e perfusione e creare un'ipossia transitoria durante l'esposizione. Quando ciò accade, aggiungere altra luce produce un effetto aggiuntivo di tipo II scarso o nullo. Il frazionamento e l'irradianza più bassa vengono studiati anche come risposte a questo vincolo; è anche per questo che i margini di sicurezza e l'ossigenazione tissutale rientrano negli standard di sicurezza e supervisione clinica, non nel manuale di una lampada.
Una procedura guidata da un medico, non una ricetta domestica
Il trattamento studiato viene eseguito dove diagnosi, dosimetria e supervisione coesistono. Qualcuno deve confermare la natura della lesione e la sua estensione in profondità, scegliere una formulazione e un intervallo tra applicazione del composto e illuminazione adatti al bersaglio, calibrare la sorgente su un campo definito con una geometria definita e monitorare cute, occhi, dolore e risposta locale del tessuto. La rassegna sullo sviluppo dei fotosensibilizzanti fenotiazinici alla base di questa trattazione presenta l'intero settore come un'ottimizzazione del rapporto struttura-attività in condizioni controllate, non come l'abbinamento di un colorante a una generica luce rossa.
L'imitazione domestica non consente di controllare nessuna di queste variabili. Le lampade destinate ai consumatori raramente riportano l'irradianza spettrale calibrata alla distanza di trattamento. La concentrazione del colorante applicato non dice nulla sulla frazione monomerica o sulla localizzazione intracellulare. L'ossigenazione tissutale è sconosciuta e cambia durante l'esposizione. Nessuno degli intervalli citati giustifica un protocollo domestico e questo articolo, per scelta, non fornisce alcuna ricetta utilizzabile. Chi valuta la qualità generale delle evidenze dovrebbe consultare come leggere uno studio sul blu di metilene prima di trarre conclusioni da un singolo articolo, mentre chi è interessato ad approcci basati soltanto sulla luce, senza fotosensibilizzante, dovrebbe iniziare da terapia con luce rossa senza fotosensibilizzante.
Cosa non dimostra questo articolo
Questo articolo non dimostra che la terapia fotodinamica con blu di metilene guarisca alcuna patologia cutanea, elimini alcuna infezione o tratti alcun tumore. Le rassegne sui meccanismi citate qui hanno misurato la fotochimica e confrontato le strutture dei coloranti; non hanno prescritto alcuna concentrazione o fluenza clinica. Gli intervalli dei parametri riportati sopra provengono da studi eterogenei sull'uomo e da modelli animali con bersagli, profondità, formulazioni ed endpoint diversi, e non se ne può ricavare una media da usare come indicazione. Le evidenze specifiche sui tumori, compresi i limiti delle prime segnalazioni cliniche su carcinoma basocellulare, sarcoma di Kaposi e melanoma, vengono valutate separatamente nella raccolta sulla ricerca oncologica. Le questioni relative alla purezza e all'approvvigionamento del materiale di grado da laboratorio sono indipendenti dal trattamento e vengono affrontate in come scegliere un prodotto a base di blu di metilene.