वे प्रयोग जिन्होंने मेथिलीन ब्लू को कोशिकीय श्वसन से जोड़ा

फाइब्रिन हटाए गए मानव रक्त को तीन घंटे तक 37 °C पर रखने से उसमें मौजूद ऑक्सीजन का लगभग दो प्रतिशत खर्च होता है। ऊष्मायन से पहले उसमें थोड़ी मात्रा में मेथिलीन ब्लू मिलाने पर वही रक्त लगभग पैंसठ प्रतिशत ऑक्सीजन खर्च करता है। कोशिकाओं में कुछ नहीं बदला। केवल विलयन बदला।

यह संख्या जॉन्स हॉपकिन्स में जॉर्ज हैरॉप और ई. एस. गुज़मान बैरन के 1928 के शोधपत्र से आती है। यही उस बार-बार दोहराए जाने वाले कथन का स्रोत है कि मेथिलीन ब्लू कोशिकीय श्वसन में सुधार करता है। यह कथन गलत नहीं है, लेकिन इसका अर्थ जितना व्यापक लगता है, वास्तव में उससे सीमित है।

तालिका की संख्या वास्तव में क्या मापती है

मापा गया अंतिम परिणाम ऑक्सीजन का ग्रहण था, जिसे गैस विश्लेषण से निर्धारित किया गया। हैरॉप और बैरन ने ताज़ा निकाले गए रक्त से श्वेत रक्त कोशिकाएँ हटाने के लिए उसे 10 °C पर रूई से छाना, नमूने को ऑक्सीजन से संतृप्त किया, उसे दो हिस्सों में बाँटा, एक हिस्से में रंजक मिलाया और ऊष्मायन के बाद दोनों का विश्लेषण किया। श्वेत रक्त कोशिकाओं की संख्या शायद ही कभी प्रति घन मिलीमीटर लगभग एक हज़ार से अधिक हुई। ऑक्सीजन की खपत को नमूने में शुरू में मौजूद ऑक्सीजन के उस हिस्से के रूप में बताया गया जो गायब हो गया था।

उन्होंने कार्बन डाइऑक्साइड भी मापी, लेकिन वहाँ विधि ने मुश्किल पैदा की। फाइब्रिन हटाए गए रक्त ने ऊष्मायन के पहले घंटे में प्रति 100 mL दो मिलीमोल तक कार्बन डाइऑक्साइड छोड़ी। इसके कारण अध्ययन की जा रही अभिक्रिया से असंबंधित थे, इसलिए संपूर्ण रक्त से निकाले गए श्वसन गुणांक उपयोग के योग्य नहीं थे। केवल लॉक के विलयन में धुली हुई कोशिकाओं से ऐसे आँकड़े मिले जिनकी व्याख्या की जा सकती थी। रंजक की मौजूदगी और अनुपस्थिति, दोनों में ये आँकड़े 0.73 से 0.80 के बीच थे।

यह विवरण मामूली नहीं है। इन शोधपत्रों में "श्वसन" का अर्थ बंद पात्र में गैसों का आदान-प्रदान है। ऑक्सीजन की खपत और उपयोगी ऊर्जा उत्पादन के बीच के अंतर की अलग से चर्चा ऑक्सीजन की खपत ATP के बारे में क्या बताती है और क्या नहीं में की गई है।

जिन कोशिकाओं में श्वसन सबसे कम था, उनमें रंजक ने सबसे अधिक बढ़ोतरी की

स्तनधारियों की परिपक्व एरिथ्रोसाइट, यानी लाल रक्त कोशिकाओं, में मापने योग्य ऑक्सीजन की खपत लगभग नहीं होती। पक्षियों की केंद्रक वाली एरिथ्रोसाइट में होती है। हैरॉप और बैरन ने दोनों का परीक्षण किया, और उनके बीच का अंतर उनके तर्क का मुख्य आधार है।

स्तनधारियों के नमूनों में रंजक ने बीस से पचास गुना तक बढ़ोतरी की। हंस के रक्त में, जिसकी कोशिकाएँ पहले से श्वसन करती थीं, उसने दर को कभी भी दो गुने से अधिक नहीं बढ़ाया। शुरुआती श्वसन जितना अधिक था, रंजक उतनी ही कम बढ़ोतरी कर पाया।

एक ही प्रजाति के भीतर भी यही क्रम दिखता है। पॉलीसाइथीमिया वेरा वाले एक रोगी के मानव रक्त नमूने में अपरिपक्व कोशिकाएँ थीं। रंजक की अनुपस्थिति में इस नमूने ने अपनी ऑक्सीजन का 11.3 प्रतिशत खर्च किया, जबकि स्वस्थ दाता की धुली हुई कोशिकाओं ने 2.8 प्रतिशत खर्च किया। रंजक इसे केवल 63.4 प्रतिशत तक ले गया। यह छह गुना बढ़ोतरी थी, जबकि सामान्य कोशिकाओं में लगभग तीस गुना बढ़ोतरी हुई। रंजक ने परिपक्व कोशिकाओं के व्यवहार को अपरिपक्व कोशिकाओं के व्यवहार की ओर धकेला। लेखकों ने भी यही कहा था कि वह ऐसा कर रहा है।

सायनाइड को इसे रोक देना चाहिए था

यह ज्ञात था कि सायनाइड कोशिकीय ऑक्सीकरण को रोकता है। फिर भी हैरॉप और बैरन ने रंजक के साथ उसे भी मिलाया।

गोवंशीय रक्त के परिणाम इसका प्रतिनिधि उदाहरण हैं। कुछ भी मिलाए बिना तीन घंटे में ऑक्सीजन की मात्रा 22.61 से घटकर 22.03 आयतन प्रतिशत हो गई। मेथिलीन ब्लू के साथ यह घटकर 12.84 हो गई। मेथिलीन ब्लू और एक पाँच-हज़ारवाँ मोलर पोटैशियम सायनाइड के साथ यह घटकर 12.74 हो गई। रंजक का प्रभाव लगभग अप्रभावित रहा।

चित्र: मानव एरिथ्रोसाइट के सूक्ष्म श्वसन का निरंतर रिकॉर्ड। तीर उस समय को दिखाता है जब मेथिलीन ब्लू मिलाया गया। उससे पहले रेखा लगभग समतल है; उसके बाद वह लगातार ऊपर जाती है। हैरॉप और बैरन, Journal of Experimental Medicine 48:207–223 (1928), PMID 19869478 से पुनर्प्रकाशित।

उनका निष्कर्ष था कि रंजक ऑक्सीजन वाहक की तरह काम करता है, "ऐसा पदार्थ उपलब्ध कराता है जो वयस्क स्तनधारियों की केंद्रकहीन एरिथ्रोसाइट से गायब हो चुका है।" दो वर्ष बाद रॉकफेलर संस्थान में माइकेलिस और सोलोमन ने इस मतभेद को वह रूप दिया जो तब से बना हुआ है। या तो रंजक का प्रभाव "रंजक का एक आकस्मिक गुण" था, या रंजक "जीवों में किसी अज्ञात पदार्थ का मॉडल" था। इन दो संभावनाओं के बीच का प्रश्न अब तक हल नहीं हुआ है। जो बदला है, वह यह है कि अब कोशिकाओं का वर्णन कहीं अधिक सटीकता से किया जा सकता है।

यकृत के अर्क ने भी यही किया

माइकेलिस और सोलोमन ने दिखाया कि अंगों से ठंडे पानी में निकाले गए अर्क भी वही उत्तेजना पैदा करते हैं। चूहे के यकृत का प्रभाव सबसे अधिक था, उसके बाद गुर्दे, प्लीहा और वृषण का। मस्तिष्क, मांसपेशी और रक्त सीरम का प्रभाव बहुत कम था या बिल्कुल नहीं था।

इसके बाद उन्होंने कार्बन मोनोऑक्साइड की मौजूदगी में अर्क का परीक्षण किया। 98 प्रतिशत कार्बन मोनोऑक्साइड और 2 प्रतिशत ऑक्सीजन के मिश्रण में अर्क या रंजक से प्रेरित श्वसन अपरिवर्तित रहा। उसी गैस मिश्रण ने यीस्ट और केंद्रक वाली मुर्गी की एरिथ्रोसाइट के श्वसन को लगभग 60 से 80 प्रतिशत तक बाधित किया। यह कार्बन मोनोऑक्साइड के प्रति संवेदनशील श्वसन एंजाइम के बारे में वारबर्ग के विवरण के अनुरूप था। इसलिए ऊतक का वह अज्ञात पदार्थ वारबर्ग का एंजाइम नहीं था।

इस प्रक्रिया में उस पदार्थ की पहचान के कई संभावित विकल्प खारिज हुए। अपचयित ग्लूटाथियोन और सिस्टीन ने केवल उतनी ही ऑक्सीजन की खपत कराई जितनी उनके अपने ऑक्सीकरण के लिए आवश्यक थी। हार्डन और यंग के सहएंजाइम को इसलिए खारिज किया गया क्योंकि वह मांसपेशी में सबसे अधिक होता है, जबकि मांसपेशी का प्रभाव लगभग सबसे कम था। कुछ वर्ष पहले नाम दिया गया कीलिन का साइटोक्रोम भी इसी विरोधाभास से टकराया। सक्रिय पदार्थ कोशिका के केंद्रक से आता है, इस अपनी धारणा को उन्होंने केवल एक सुझाव कहा।

प्रभाव के साथ कुछ शर्तें जुड़ी थीं

कोशिकाओं का अखंड होना आवश्यक था। आसुत जल या बार-बार जमाने से हुए हीमोलाइसिस, यानी लाल रक्त कोशिकाओं के टूटने, ने रंजक और अर्क दोनों के प्रति प्रतिक्रिया समाप्त कर दी। आंशिक हीमोलाइसिस ने प्रतिक्रिया को उसी अनुपात में कम किया।

शर्करा भी आवश्यक थी। ग्लूकोज़, फ्रुक्टोज़ और सुक्रोज़ ने रंजक से प्रेरित श्वसन को सहारा दिया; मैनिटॉल ने नहीं। शर्करा की अनुपस्थिति में श्वसन बिल्कुल नहीं हुआ। इस प्रक्रिया में रंजक कोशिकाओं को नुकसान पहुँचाता प्रतीत हुआ, इसलिए एक या दो घंटे बाद ग्लूकोज़ मिलाने से श्वसन बहाल नहीं हुआ। लेखकों ने सुझाव दिया कि रंजक किसी ऐसे संरचनात्मक घटक का ऑक्सीकरण कर रहा था जिसकी कोशिका को आवश्यकता थी।

प्रकाश ने रंजक का प्रभाव काफ़ी बढ़ाया, हालाँकि अंधेरे में भी प्रभाव स्पष्ट था। अन्य अपचयित हो सकने वाले रंजकों का व्यवहार अलग था: टोलुइलीन ब्लू का प्रभाव मेथिलीन ब्लू के बराबर या उससे अधिक था, जबकि इंडिगो डाइसल्फोनेट ने लगभग कुछ नहीं किया। रंजक के ऑक्सीकरण-अपचयन विभव और उसके प्रभाव की मात्रा के बीच कोई स्पष्ट संबंध नहीं मिला। लेखकों ने इसका कारण झिल्ली की पारगम्यता और विषाक्तता को माना।

प्रभाव किण्वन के साथ बदलता था, श्वसन के साथ नहीं

बैरन का 1930 का अध्ययन कोशिका निलंबनों से आगे बढ़कर चूहों के सामान्य अंगों और प्रत्यारोपित ट्यूमर के ऊतक खंडों पर गया।

जिन ऊतकों में वायवीय ग्लाइकोलाइसिस नहीं था, उनमें मेथिलीन ब्लू ने कोई प्रभाव नहीं डाला या ऑक्सीजन की खपत थोड़ी कम की: गुर्दे में लगभग 14 प्रतिशत, अग्न्याशय में लगभग 14 प्रतिशत और यकृत में लगभग 5 प्रतिशत। जो ऊतक ऑक्सीजन की मौजूदगी में किण्वन करते हैं, उनमें उसने खपत बढ़ाई: प्लीहा में लगभग 8 प्रतिशत और मस्तिष्क में लगभग 13 प्रतिशत। ट्यूमर में बढ़ोतरी मानव स्तन कार्सिनोमा में लगभग 27 प्रतिशत से लेकर राउस चिकन सार्कोमा में 80 प्रतिशत से अधिक तक थी। यह लगभग प्रत्येक ऊतक के वायवीय ग्लाइकोलाइसिस के अनुपात में थी।

चित्र: प्रत्येक बिंदु एक ऊतक प्रकार है। क्षैतिज अक्ष वायवीय ग्लाइकोलाइसिस दिखाता है; ऊर्ध्वाधर अक्ष मेथिलीन ब्लू के बाद ऑक्सीजन की खपत में परिवर्तन दिखाता है। आँकड़े बैरन, Journal of Experimental Medicine 52:447–456 (1930), तालिका 6, PMID 19869777 से लिए गए हैं।

इसके बाद सायनाइड के प्रयोग में उलटा परिणाम मिला। जब पहले प्रतिक्रिया न देने वाले उन ऊतकों में सायनाइड से श्वसन रोका गया और किण्वन सामने आया, तो रंजक ने फिर से ऑक्सीजन की खपत बढ़ाई: गुर्दे में लगभग 59 प्रतिशत, यकृत में लगभग 19 प्रतिशत, प्लीहा में लगभग 286 प्रतिशत और वृषण में लगभग 200 प्रतिशत।

बैरन ने प्रस्ताव दिया कि रंजक किसी कोशिका या ऊतक की किण्वन क्षमता के परीक्षण के रूप में काम कर सकता है। उन्होंने अंत में एक अनुमान रखा: रंजक युक्त माध्यम में कई पीढ़ियों तक ट्यूमर का संवर्धन किसी दिन उसके चयापचय को स्थायी रूप से सामान्य ऊतक जैसा बना सकता है। यह 1930 में लिखा गया एक शोध प्रश्न था। यह उपचार का दावा नहीं है।

इन प्रयोगों में क्या मापा ही नहीं जा सकता था

1928 और 1930 में "श्वसन" का अर्थ ऑक्सीजन की खपत था। एडेनोसिन ट्राइफॉस्फेट का पहला विवरण 1929 में प्रकाशित हुआ। पृथक माइटोकॉन्ड्रिया इलेक्ट्रॉनों का स्थानांतरण करते समय फॉस्फेट का एस्टरीकरण करते हैं, इसका प्रदर्शन 1949 में हुआ। मेथिलीन ब्लू के शुरुआती शोधपत्रों में से कोई भी ऊर्जा उत्पादन नहीं माप सकता था, और किसी ने ऐसा करने का दावा भी नहीं किया।

दूसरी समस्या कोशिकाएँ हैं। स्तनधारियों की परिपक्व एरिथ्रोसाइट में माइटोकॉन्ड्रिया नहीं होते। रेटिकुलोसाइट अवस्था के दौरान वे चयनात्मक ऑटोफैजी से माइटोकॉन्ड्रिया और राइबोसोम हटा देती हैं। इसीलिए परिपक्व लाल रक्त कोशिका ग्लाइकोलाइसिस से काम चलाती है और अपने पेंटोज़ फॉस्फेट मार्ग पर मुख्यतः NADPH के लिए निर्भर रहती है, ATP के लिए नहीं। 1928 के प्रयोगों में मरम्मत करने के लिए कोई इलेक्ट्रॉन परिवहन शृंखला मौजूद ही नहीं थी। जो भी ऑक्सीजन खर्च कर रहा था, वह कुछ और कर रहा था।

वह कुछ और क्या था, इसका अब काफ़ी स्पष्ट वर्णन उपलब्ध है। मेथिलीन ब्लू कोशिका में मौजूद अपचायक समतुल्यों से इलेक्ट्रॉन स्वीकार करके ल्यूकोमेथिलीन ब्लू बन जाता है। आणविक ऑक्सीजन उसका फिर से ऑक्सीकरण करती है, जिससे चक्र पूरा होता है। मानव लाल रक्त कोशिकाओं में NADPH पर निर्भर फ्लेविन रिडक्टेज़ और संबंधित डाइसल्फाइड रिडक्टेज़ अपचयन का चरण पूरा करते हैं। चिह्नित ग्लूकोज़ का उपयोग करने वाले 1976 के एक अध्ययन में पाया गया कि रंजक हेक्सोज़ मोनोफॉस्फेट शंट को उत्तेजित करता है, कम सांद्रता वाला प्रभाव ऑक्सीहीमोग्लोबिन पर निर्भर था और अधिक सांद्रता, 0.1 mM, पर हाइड्रोजन पेरॉक्साइड बना। अपचयित रंजक ऑक्सीजन से मिलने पर पेरॉक्साइड बनाता है, फॉस्फेट बंध नहीं।

माइटोकॉन्ड्रिया में स्थिति लोकप्रिय सारांशों में स्वीकार किए जाने से अधिक विवादित है। शोध की एक धारा के अनुसार रंजक कॉम्प्लेक्स I के क्षेत्र से इलेक्ट्रॉन लेकर उन्हें साइटोक्रोम c को देता है। एक अन्य अध्ययन में पाया गया कि चूहे के मस्तिष्क के माइटोकॉन्ड्रिया में यह एंटीमाइसिन से अवरोध के बाद श्वसन बहाल नहीं कर सकता। उस अध्ययन ने इसके बजाय इलेक्ट्रॉन स्वीकार करने की जगह कॉम्प्लेक्स III के यूबिक्विनॉल-बंधन स्थल पर रखी। तीसरे अध्ययन में पाया गया कि कम सांद्रताओं ने विश्राम अवस्था में ऑक्सीजन की खपत बढ़ाई, जबकि ADP से उत्तेजित श्वसन अपरिवर्तित रहा। इस बात का सबसे सीधा कथन यह है कि मेथिलीन ब्लू से प्रेरित ऑक्सीजन की खपत ऑक्सीडेटिव फॉस्फोराइलेशन पर बिल्कुल निर्भर नहीं करती: यह श्वसन शृंखला बाधित होने पर भी जारी रही और ऐसे नमूनों में भी हुई जिनमें श्वसन शृंखला थी ही नहीं।

इन दोनों मात्राओं के बीच के अंतर के प्रत्यक्ष मापन भी उपलब्ध हैं। चूहे के यकृत से पृथक माइटोकॉन्ड्रिया में रंजक की बढ़ती सांद्रताओं ने श्वसन नियंत्रण अनुपात घटाए और सूजन पैदा की। लेखकों ने इसे ऑक्सीडेटिव फॉस्फोराइलेशन का वियुग्मन कहा। परफ्यूज़ किए गए चूहे के यकृत में मेथिलीन ब्लू ने ऑक्सीजन की खपत बढ़ाई, जबकि ATP और ADP का अनुपात घटा।

नैदानिक अभिलेख भी यही संदेश देता है। मेथीमोग्लोबिनेमिया का उपचार NADPH पर निर्भर अपचयन मार्ग के माध्यम से अंतःशिरा दिए जाने वाले प्रति किलोग्राम लगभग एक से दो मिलीग्राम मेथिलीन ब्लू से किया जाता है, और अधिक खुराकें उसी स्थिति को पैदा करती हैं जिसका उपचार किया जा रहा है। उसी समीक्षा में कहा गया है कि प्रतिविष प्रभाव अखंड एरिथ्रोसाइट में सबसे अधिक होता है और हीमोलाइसिस होने पर कम हो जाता है। यह 1930 में हीमोलाइसिस के बारे में मिला निष्कर्ष है, जो तिहत्तर वर्ष बाद अस्पताल के संदर्भ में फिर सामने आया। जिस यौगिक के उपयोगी और हानिकारक प्रभाव खुराक की एक सीमा के विपरीत पक्षों पर हों, उसकी खुराक ऑक्सीजन की खपत के मापन से नहीं निकाली जानी चाहिए।

बैच को चर्चा में शामिल करना क्यों आवश्यक है

हैरॉप और बैरन ने एक ऐसी बात देखी जिसे दोबारा पढ़ना चाहिए। मेथिलीन ब्लू स्वयं स्पेक्ट्रोस्कोप में मेथीमोग्लोबिन की दो विशिष्ट पट्टियों के बीच एक पट्टी पैदा करता है, "जिससे सरसरी जाँच में आसानी से भ्रम हो सकता है।" रंजक उस पदार्थ जैसा दिखाई दे सकता है जिसे खोजा जा रहा है।

इसी समस्या का एक रासायनिक रूप भी है। गौण घटक के रूप में मौजूद संबंधित फीनोथियाज़ीन का अपना ऑक्सीकरण-अपचयन व्यवहार, अपनी पारगम्यता और अपनी विषाक्तता होती है। एक दर्ज उदाहरण इससे जुड़े परिणामों को स्पष्ट करता है: मेथिलीन ब्लू के आयोडीनीकरण के एक अध्ययन में लगभग 7 से 8 प्रतिशत Azure B वाले नमूनों ने मुख्यतः आयोडीनीकृत Azure B बनाया। इसलिए अभिक्रिया में मेथिलीन ब्लू के बजाय अशुद्धि का प्रभाव प्रमुख था।

प्रयोगशाला में, अभिरंजन कार्यस्थल पर या एक्वेरियम में मेथिलीन ब्लू को अभिकर्मक के रूप में उपयोग करने वाला कोई भी व्यक्ति ऐसी सामग्री के साथ काम कर रहा है जिसके घटकों का विवरण निर्धारित नहीं है, जब तक कि बैच का अभिलक्षणन न किया गया हो। संबंधित पदार्थ, पहचान, तत्त्वीय अशुद्धियाँ, अवशिष्ट विलायक और प्रज्वलन के बाद बचा अवशेष प्रयोग का हिस्सा हैं, उसके आसपास की कागज़ी कार्रवाई नहीं। Blupreme अपना मेथिलीन ब्लू एक औषधि निर्माता से प्राप्त करता है और विश्लेषण का पूरा प्रमाणपत्र प्रकाशित करता है। इसमें केवल भारी धातुओं के बजाय संपूर्ण USP विनिर्देश का परीक्षण किया जाता है। विश्लेषण प्रमाणपत्र पढ़ने की मार्गदर्शिका और USP-ग्रेड पदनाम क्या स्थापित करता है और क्या नहीं बताते हैं कि दस्तावेज़ को दावे के संदर्भ में कैसे जाँचा जाए।

संख्या सही थी

1928 और 1930 के प्रयोग सावधानी से किए गए थे, और उनका मुख्य अवलोकन आज भी कायम है: अपचयित हो सकने वाला रंजक ऐसी कोशिका में, जिसमें श्वसन लगभग नहीं होता, विश्राम अवस्था की दर से कई गुना अधिक ऑक्सीजन की खपत करा सकता है, उस चरण से गुज़रे बिना जिसे सायनाइड रोकता है।

गलती बाद में होती है, जब "श्वसन" को उसके आधुनिक अर्थ में पढ़ा जाता है। गैस विनिमय का मापन बताता है कि इलेक्ट्रॉन ऑक्सीजन तक पहुँचे। यह नहीं बताता कि उनमें से किसी का उपयोग ATP बनाने में हुआ। जिस कोशिका में माइटोकॉन्ड्रिया नहीं हैं, उसमें इन दोनों कथनों के बीच का अंतर जितना व्यापक हो सकता है, उतना ही है। कोशिकाओं में मेथिलीन ब्लू क्या करता है, इसका व्यापक मानचित्र इसी अंतर को बड़े संदर्भ में रखता है, और रंजक से औषधि तक इस यौगिक का इतिहास बताता है कि वस्त्रों का एक रंगकारक इन प्रयोगों तक पहुँचा कैसे।