זיהוי מתילן כחול במעבדה: ספקטרום אינפרה־אדום ושיטות משלימות

דמיינו ששלוש מעבדות מקבלות את אותה אבקה כחולה. הראשונה מודדת ספקטרום אינפרה־אדום ומכריזה שזהו מתילן כחול. השנייה מבצעת כרומטוגרפיה ומדווחת על 0.4% Azure B. השלישית מבצעת דיפרקציית קרני רנטגן בגבישים ומזהה צורת הידרט. שלושתן צודקות, ואף אחת מהן לא ענתה על שתי השאלות האחרות. הבלבול מתחיל כשמפרשים תוצאה אחת כאילו היא עונה על שלושתן.

מאמר זה מפריד בין השאלות הללו. זיהוי באינפרה־אדום מאמת זהות מולקולרית מול תקן ייחוס. כרומטוגרפיה קובעת את ההרכב. דיפרקציה קובעת את הצורה במצב המוצק. התאמה שעברה את בדיקת הזהות אינה תעודת טוהר.

זיהוי באינפרה־אדום עונה היטב על שאלה אחת

בדיקת הזהות הפרמקופיאלית למתילן כחול היא השוואה של ספקטרום מול תקן, ולא רשימת תיוג של פסגות. בתצוגה המקדימה של מונוגרפיית USP למתילן כחול, בדיקת זיהוי A מפנה לספקטרוסקופיית אינפרה־אדום באמצעות אופטיקת ATR או דיסקית אשלגן ברומיד. ספקטרום הדגימה חייב להתאים לספקטרום של תקן הייחוס של USP, כאשר הדגימה והתקן מוכנים ונמדדים בתנאים שקולים. אין רשימה קבועה של מספרי גל אבחנתיים שעליה נשענת ההכרעה. ההכרעה נשענת על חפיפת הספקטרומים.

בחירה זו משקפת את התנהגות ספקטרומי ה-FTIR של מתילן כחול. המאפיינים הבולטים ביותר נמצאים באזור טביעת האצבע. שיוכי הפסים בספרות ממקמים בעקביות את הפס העיקרי של הטבעת המצומדת בסביבות 1590 עד 1600 cm-1, שם מצומדים אופני מתיחה של קשרי פחמן-פחמן ופחמן-חנקן ארומטיים. פסים נוספים בסביבות 1490 ו-1390 cm-1 מתאפיינים בדפורמציות של הטבעת ושל קשרי פחמן-חנקן ופחמן-מימן. פסים בסביבות 1355 ו-1330 cm-1 קשורים לקשרי פחמן-חנקן בקבוצות הדימתילאמינו ולדפורמציות של קבוצות מתיל. מאפיינים בסביבות 1225 עד 1250 cm-1 שייכים לשלד ההטרוציקלי, ואילו פסים בסביבות 1170 עד 1130 וב-1066 cm-1 קשורים לקשרי פחמן-גופרית, לצד כיפוף C-H ארומטי בסביבות 880 cm-1. אופני מתיחה מופיעים במספרי גל גבוהים יותר: C-H ארומטי בסביבות 3040 cm-1 ו-C-H של N-מתיל בטווח של כ-2900 עד 3000 cm-1. השיוכים שפורסמו נבדלים בפרטים משום ששלד הפנותיאזיניום רוטט כמערכת מצומדת, ולכן יש להתייחס לכל טבלת שיוכים כאל דיווח מסוים, ולא כאל האפשרות היחידה.

שתי השפעות של הכנת הדגימה ראויות לתשומת לב, משום שהן משנות את ספקטרום ה-IR של מתילן כחול בלי לשנות את הצבען. ראשית, חומר בצורת הידרט מציג מעטפת O-H רחבה בסביבות 3300 עד 3500 cm-1 וכן כיפוף של מים בסביבות 1630 עד 1640 cm-1, וצורות הידרט שונות מסיטות את פסי טביעת האצבע במידה מדידה. שנית, מטריצת דיסקית ה-KBr היא היגרוסקופית: לחות שנספגת בה יוצרת פסים בדיוק באותם אזורים של מים, ועלולה להיראות כמי הידרט שמקורם בדגימה. מדידה ב-ATR נמנעת משימוש במטריצת KBr, אך עוצמות האות ב-ATR משתנות בהתאם לעומק החדירה התלוי במספר הגל, ולכן אי אפשר לחפוף ישירות ספקטרום ATR וספקטרום העברה של אותה אבקה. הכלל המעשי נובע מהדרישה הפרמקופיאלית: יש להשוות דגימה ותקן ייחוס שנמדדו באותה טכניקה, ולתעד באיזו טכניקה נעשה שימוש. להסבר על הכימיה של הקטיון, המלח וההידרטים שמאחורי ספקטרומים אלה, ראו את מקור הייחוס למבנה ולתכונות של מתילן כחול.

טבלה לבחירת שיטה אנליטית

טבלה זו היא כלי לבחירת השיטה. קראו כל שורה כדי לברר על איזו שאלה השיטה עונה, מה מאשרת תוצאה שעומדת בדרישות ומה עדיין לא הוכח.

מדוע התאמה באינפרה־אדום אינה תעודת טוהר

התאמה בבדיקת הזהות שוללת זיהוי של הצבען הלא נכון. היא אינה ממפה את כל מרכיבי הדגימה. שלוש מגבלות חשובות במיוחד.

ראשית, חומרים קרובים דומים זה לזה באינפרה־אדום. Azure B נבדל ממתילן כחול בקבוצת מתיל אחת בלבד, ולכן הספקטרום שלו דומה מאוד לזה של מתילן כחול. תערובת המכילה אחוזים בודדים של Azure B עדיין חופפת היטב לספקטרום ייחוס של מתילן כחול. גילוי הזיהום הזה הוא משימה לכרומטוגרפיה, כפי שמוסבר במדריך לזיהומים במתילן כחול ולשיטות בדיקה.

שנית, ספקטרוסקופיית אינפרה־אדום היא טכניקה המודדת את הדגימה בכללותה, עם רגישות מוגבלת לרכיבים בכמויות קטנות. כמויות קטנות של צבעים קרובים, ממסים שאריתיים או שאריות אנאורגניות מסתתרות מתחת לפסים העיקריים. היעדר פסגות נוספות הוא ראיה חלשה להיעדר זיהומים.

שלישית, תקן הייחוס קובע את בסיס ההשוואה כולה. תקן שהתפרק, שהספקטרום שלו הוסט עקב שינוי בהידרציה או שטופל באופן לא תקין משנה את אמת המידה. כך גם שילוב לא תואם של טכניקות, כגון השוואת ספקטרום דגימה שנמדד ב-ATR לתקן ייחוס שנמדד ב-KBr. יש לתעד את אצוות התקן, את הטכניקה ואת אופן ההכנה לצד כל הכרעה.

תערובות מחייבות אזהרה נוספת. ספקטרום שמתאים ברובו, אך מציג כתפיים או חריגות בעוצמה, אינו תוצאה תקינה עם הערות שוליים. זהו סימן שיש להפריד את מרכיבי הדגימה לפני זיהוים.

שיטות משלימות בפועל

HPLC של מתילן כחול מספק את התשובה לגבי ההרכב שספקטרוסקופיית אינפרה־אדום אינה יכולה לספק. השיטה הפרמקופיאלית הנוכחית משתמשת בעמודה מסוג פניל ובגרדיאנט מים-אצטוניטריל המכיל חומצה טריפלואורואצטית, עם גילוי ב-246 nm ולא בתחום הנראה. הזהות נקבעת לפי התאמת זמן השהייה לתקן הייחוס; אותה השוואה משמשת גם לקביעת התכולה. בדיקת הזיהומים האורגניים מזהה Azure B באמצעות חומר ייחוס משלו, בזמן שהייה יחסי של כ-0.8 לעומת מתילן כחול ב-1.0, ודורשת רזולוציה גבוהה בין שתי הפסגות. שימו לב לבחירת אורך הגל: סדרת הדה־מתילציה בולעת בהדרגה קרוב יותר לתחום האדום, מתיונין בסביבות 600 nm דרך Azure C, Azure A ו-Azure B ועד מתילן כחול בסביבות 670 nm. לכן גלאי המכוון לאורך גל קבוע בסביבות 660 nm מגיב באופן לא אחיד לחברי הסדרה ומעריך בחסר חלק מההומולוגים. כשנדרש אפיון מלא של כל הסדרה, יש לבצעו בשיטת LC-MS/MS עם עמודת C18 ותקנים שאושרה התאמתם לכל אנליט.

דיפרקציית אבקה עונה על השאלה לגבי המצב המוצק, ששתי השיטות שלעיל הורסות את המידע הדרוש לה או מתעלמות ממנו: המסת האבקה לצורך כרומטוגרפיה מוחקת את המידע על הגביש, ותנודות מולקולריות מעידות על קשרים ולא על אריזה מסודרת לטווח ארוך. דפוסי דיפרקציה מבחינים בין פאזות הידרט ובין דרגות גבישיות, ומתילן כחול זקוק לבחינה זו יותר מרוב החומרים. מחקר במצב המוצק של ראגר ועמיתיו זיהה חמישה מבני הידרט נבדלים, ובהם פנטהידרט, שני דיהידרטים, מונוהידרט והידרט ביניים, ולא מצא טריהידרט אמיתי בין הצורות שאופיינו. אופן הטיפול במעבדה חשוב כאן: לחות וטמפרטורה משנות את יציבות ההידרטים, וטחינה אגרסיבית עלולה לשנות את הפאזה או לפגוע בגבישיות. לכן יש לבקר ולתעד את הלחות היחסית ואת הטמפרטורה, ולצמצם את הטחינה למינימום. סימון ההידרטים והשפעתו על המסה הנשקלת נידונים בהרחבה בצורות הידרט של מתילן כחול וסימונן.

בליעה ב-UV-Vis ממלאת תפקיד תומך. שיאי הבליעה המוכרים מאשרים שהתמיסה מתנהגת כמצופה ומאפשרים קביעת ריכוז, אך תמיסה כחולה הבולעת באורך הגל הצפוי מתיישבת עם נוכחות מתילן כחול בלי להוכיח אותה, משום שצבעים קרובים בולעים באורכי גל סמוכים.

מה לשאול לפני הרכישה

הפכו את ההבחנות הללו לשאלות בעת הרכישה. שאלו איזו אצווה נבדקה, באיזו טכניקה נקבעה הזהות, האם בדיקת הזיהומים ב-HPLC השתמשה בחומר הייחוס של Azure B, והאם צורת ההידרט אופיינה או רק הונחה. מעל הכול, שאלו אם התעודה מכסה את המפרט המלא או רק בדיקות נבחרות. מוכרים רבים הטוענים לעמידה בדרישות פרמקופיאליות בודקים רק מתכות כבדות, וכך משאירים ללא מענה את השאלות לגבי זהות, תכולה, זיהומים אורגניים, ממסים והיבטים מיקרוביאליים.

Blupreme בודקת את מלוא מפרט USP, הכולל זהות, טוהר, זיהומים אורגניים, ממסים שאריתיים, זיהומים יסודיים, שארית לאחר הצתה, גבולות מיקרוביאליים ואנדוטוקסינים חיידקיים, בשיתוף עם יצרן מתילן כחול לתעשיית התרופות. תעודת האנליזה הציבורית לכל אצווה מתפרסמת בעמוד בדיקות האיכות של Blupreme, כך שאפשר לקרוא ישירות את בסיס חישוב התכולה ואת תוצאות הזיהומים, במקום להסיק אותם. גם בתוצאות הקרובות ל-100% יש לציין את בסיס החישוב, כפי שמסביר המדריך לתוצאות תכולה מעל 100 אחוז. התאמה בבדיקת הזהות פותחת את הבירור. התיעוד המלא משלים אותו.