Metyleenisininen ja mitokondriot: elektroninsiirto ja tutkimusnäyttö

Kuvittele kaksi valmistetta vierekkäin. Molemmat sisältävät aivojen mitokondrioita, jotka on myrkytetty rotenonilla, hengitysketjun kompleksin I estävällä kemikaalilla. Toiseen tutkija pipetoi mikromolaarisen annoksen metyleenisinistä. Hapenkulutus palautuu osittain. Kalvojännite palautuu osittain. Pieni määrä ATP-synteesiä käynnistyy uudelleen. Viereisessä kyvetissä peroksidianturi kertoo tarinan toisen puolen: vetyperoksidin tuotanto on moninkertaistunut kaikilla testatuilla annoksilla ja kaikilla kokeilluilla substraateilla.

Molemmat mittaustulokset ovat oikeita. Metyleenisininen on elektronien kuljettaja, joka voi pitää virran kulkemassa hengitysketjun vaurioituneen osan ohi, ja sama kuljettaja perii tästä hinnan peroksidina. Kun pidät molemmat tosiasiat mielessä yhtä aikaa, metyleenisinisen vaikutuksia mitokondrioiden toimintaan käsittelevä kirjallisuus käy ymmärrettäväksi. Jos huomioit vain toisen, kirjallisuus näyttää ihmeeltä tai uhalta sen mukaan, minkä tutkimuksen avasit ensin.

Elektronien kuljetus yksinkertaisesti selitettynä

Hengitysketju on viestiketju. Elektronit tulevat ketjuun kompleksissa I (NADH:sta) tai kompleksissa II ja siihen liittyvissä flaviinientsyymeissä (sukkinaatista ja vastaavista luovuttajista), kulkevat kompleksin III kautta liikkuvalle kantajalle, sytokromi c:lle, ja sitten kompleksin IV kautta hapelle. Jokainen luovutus pumppaa protoneja sisäkalvon läpi, ja näin syntyvä gradientti ohjaa ATP-synteesiä. Jos jokin asema estetään, sitä edeltävä osa ketjusta hiljenee.

Metyleenisininen asettuu rinnakkaiseksi kuriiriksi. Sen hapettunut muoto ottaa vastaan elektroneja ketjun aiemmilta kantajilta ja muuttuu värittömäksi pelkistyneeksi muodoksi, leukometyleenisiniseksi. Tämä luovuttaa elektronit eteenpäin ketjun myöhemmille osille ja muuttuu takaisin siniseksi. Nämä kaksi muotoa kuvataan hapetus-pelkistysparia käsittelevässä artikkelissa, ja laajempi elektronien välitystoiminta kuuluu yleiseen mekanismin selitykseen. Avoin kysymys on, missä kuriiri palaa ketjuun: kompleksin III kinolin sitoutumistaskussa, jota kutsutaan Qo-kohdaksi, vai suoraan sytokromi c:ssä. Se, kumpi luovutusreitti hallitsee, riippuu olosuhteista, kuten kompleksin III ohitusta käsittelevä analyysi selittää yksityiskohtaisesti.

Mitä kolme jyrsijätutkimusta todella mittasivat

Kaikissa kolmessa tutkimuksessa käytettiin eristettyjä aivojen mitokondrioita eli solusta irrotettuja ja koostumukseltaan määriteltyyn puskuriin suspendoituja soluelimiä. Ei kokonaisia soluja, ei annosteltuja eläimiä, ei ihmiskoehenkilöitä. Pitoisuudet tarkoittavat soluelimiä ympäröivän liuoksen pitoisuuksia, eivät ihmiselle suun kautta annettavaa annosta. Kun pidät tämän rajauksen mielessä, luvut puhuvat selkeästi.

Ensimmäinen tutkimus, jossa käytettiin eristettyjä marsun aivojen mitokondrioita pitoisuuksilla 100 nanomolaarisesta 2 mikromolaariseen, kartoitti hyödyt ja haitat samassa valmisteessa. Terveissä mitokondrioissa väriaine lisäsi hapenkulutusta lepotilassa mutta ei muuttanut ADP:n stimuloimaa hengitystä, joten siihen kytkeytyvä ATP-tuotanto ei parantunut. Kun kompleksi I oli estetty, 2 mikromolaarinen pitoisuus palautti ATP-synteesin 46:sta 93 nanomooliin minuutissa milligrammaa kohti, kun normaali nopeus oli noin 1109. Kun kompleksi III oli estetty, sama pitoisuus palautti ATP-synteesin noin 46:sta 63:een, kun normaali nopeus oli noin 910. Jännite ja kalsiumin otto palautuivat osittain. Syanidin aiheuttamaa kompleksin IV estoa ei voitu ohittaa, joten hyödyllinen elektronien luovutuskohta sijaitsee toimivaa kompleksia IV edeltävässä osassa ketjua. Kaikki palautumiset olivat tilastollisesti todellisia ja pieniä: yksinumeroisia prosenttiosuuksia normaalista ATP-tuotannosta.

Toinen tutkimus, jossa käytettiin hiiren aivokuoren mitokondrioita noin 1 mikromolaarisella pitoisuudella, vahvisti kompleksin I ohituksen ja osoitti rajan kompleksin III kohdalla. Rotenoni vähensi hengityksen noin 121:stä alle 2 nanomooliin happea minuutissa milligrammaa kohti, ja väriaine nosti sen noin 21:een, suunnilleen kuudesosaan normaalista. Samalla kalvojännite palautui lähes kokonaan. Kompleksin III estämisen jälkeen hengitys ja jännite eivät kuitenkaan palautuneet pitoisuuksilla 1–5 mikromolaarista, ja esto vaimensi väriaineen aiheuttamaa peroksidisignaalia. Kirjoittajat ehdottivat, että pelkistynyt väriaine luovuttaa elektroninsa kompleksin III Qo-kohdassa: kun tämä kohta on varattu, kuriirilla ei ole paikkaa, johon toimittaa lastinsa.

Kolmas tutkimus, jossa käytettiin hiiren, rotan ja marsun aivojen mitokondrioita pääasiassa 2 mikromolaarisella pitoisuudella, testasi ristiriitaa suoraan ja havaitsi, että kompleksin III esto voidaan ohittaa. Kun Qo-kohdan estäjä myksotiatsoli vähensi perushengitystä 88 prosenttia, väriaine palautti hapenkulutuksen noin 62 prosenttiin estämättömästä tasosta. Suorassa kokeessa puolen mikromolaarin pitoisuus pelkisti ulkoisesti lisättyä sytokromi c:tä myös kompleksin III ollessa estettynä. Tämä tuki reittiä NADH:sta väriaineen kautta sytokromi c:lle ja edelleen kompleksille IV. Palautunut hengitys käyttäytyi kuitenkin poikkeavasti: lisätty ADP vähensi hapenkulutusta sen sijaan, että olisi lisännyt sitä, ja ATP-synteesin estäminen stimuloi hengitystä. Jännite palautui vain osittain. Suuri hapenkulutus, johon liittyy käänteinen kytkeytyminen, ei ole normaalia energiantuotantoa.

Miksi laboratoriot ovat eri mieltä ja mikä ratkaisee asian

Lajieroihin perustuva selitys kaatuu ensimmäisenä. Kolmas ryhmä toisti kokeet kolmella jyrsijälajilla ja havaitsi saman laadullisen ohituksen kaikissa, myös siinä hiirikannassa, jossa ohituksen oli raportoitu puuttuvan. Sen sijaan eroja on pitoisuudessa (1 vastaan 2 mikromolaarista), estäjien annoksissa, puskureissa, eristysmenetelmissä ja ennen kaikkea vertailtavassa energeettisessä tilassa: ohitus näkyy selvimmin ennen ADP:n lisäämistä, juuri siinä tilanteessa, jossa paradoksaalinen ADP-vaste ilmenee. Totuudenmukainen kaavio näyttää siksi kaksi olosuhteista riippuvaa luovutuskohtaa, yhden Qo-kohdassa ja toisen sytokromi c:ssä. Kuriiri toimittaa lastinsa sinne, minne paikallinen kemia sen sallii.

Peroksidin hinta

Haittapuoli on yhtä johdonmukainen kuin toiminnan palautuminen. Marsututkimuksessa väriaine lisäsi peroksidin vapautumista kaikissa testatuissa olosuhteissa: lepotilassa, ATP-synteesin aikana ja kemiallisesti häirityssä tilassa, kaikilla kolmella substraatilla. ATP-synteesin aikana tuotanto nousi noin 148:sta yli 1500 pikomooliin minuutissa milligrammaa kohti 1 mikromolaarisella pitoisuudella, ja jo 100 nanomolaarinen pitoisuus yli nelinkertaisti signaalin. Väriaine myös hidasti peroksidin poistumista noin 2.6-kertaisesti, joten signaali kuvastaa sekä nopeampaa muodostumista että hitaampaa poistumista. Ehdotettu kemiallinen mekanismi on hapen suora pelkistyminen pelkistyneen väriaineen vaikutuksesta ilman havaittavaa superoksidia, mutta tämä on yhä tulkinta eikä todistettu vaihe.

Hiiritutkimus monimutkaistaa kuvaa hyödyllisellä tavalla. Peroksidin määrä kasvoi jyrkästi annoksen mukana, lähtötason noin 76:sta lähes 2000 pikomooliin minuutissa milligrammaa kohti 2 mikromolaarisella pitoisuudella. Kompleksin III esto kuitenkin vaimensi väriaineen aiheuttamaa osuutta. Jos peroksidi syntyisi vain pelkistyneen väriaineen reagoidessa hapen kanssa, ketjun estämisellä ei pitäisi olla näin suurta merkitystä. Sillä on, joten ketju osallistuu prosessiin. Antioksidanttisia ja pro-oksidanttisia vaikutuksia käsittelevä katsaus asettaa tämän kaksijakoisuuden laajempaan yhteyteen, ja happea ja ATP:tä vertaileva analyysi selittää, miksi pelkät hapenkulutusluvut eivät koskaan ratkaise energiantuotantoa koskevaa väitettä.

Toiminnan palautuminen ei ole korjaantumista

Ilmaus, josta pitäisi luopua, on ”korjaako metyleenisininen mitokondrioita”. Korjaantuminen tarkoittaisi pysyvää muutosta: uudelleen rakennettuja komplekseja, kytkeytymistä, joka säilyy lääkkeen poistuttua, toiminnan palautumista kokonaisissa soluissa ja lopulta toiminnan paranemista elävässä organismissa. Yksikään näistä kolmesta tutkimuksesta ei osoita sitä. Ne osoittavat akuutin uudelleenreitityksen vastikään eristetyissä soluelimissä keinotekoisen kemiallisen eston aikana. ATP-tuotanto jää pieneksi osaksi normaalista, ja kytkeytyminen on toisinaan suorastaan outoa. Rotenoni ja antimysiini ovat laboratoriotyökaluja, eivät ikääntymisen tai ihmisen mitokondriosairauden malleja. Mikään tässä ei tarkoita lisää energiaa terveelle ihmiselle, mikä on erillinen tutkimusnäyttöä koskeva kysymys omine ihmistutkimuksineen.

Kolme rajausta pitävät biohakkerointia koskevat päätelmät rehellisinä. Ensinnäkin ympäröivän liuoksen pitoisuus ei ole annos: 0.1–2 mikromolaarinen pitoisuus eristettyjen soluelinten ympärillä ei kerro, mikä suun kautta otettava määrä tuottaisi saman vapaan pitoisuuden ihmisen aivojen mitokondrion kohdalla. Tämä on erityisen tärkeää, koska väriaineen kertyminen tai vapautuminen riippuu itse kalvojännitteestä. Toiseksi happi ei ole energiaa: väriaine voi lisätä hapenkulutusta kierron ja vuodon kautta sekä tuottavan fosforylaation kautta. Siksi hengityksen mittaaminen ilman ATP:n ja jännitteen mittauksia ei oikeuta energiantuotantoa koskevaa väitettä. Kolmanneksi hyödyn ja kuormituksen on mahduttava samaan lauseeseen: jokainen väite jännitteen tai ATP-tuotannon palautumisesta, joka jättää mainitsematta samanaikaisen peroksidin lisääntymisen, kuvaa kokeen väärin. Asiaan liittyviä lisärajauksia käsitellään artikkeleissa NAD:n hapetus-pelkistystasapainosta, annosvasteen muodosta ja määritysmenetelmien valintaoppaassa.

Yksi käytännön huomautus: elektronien kuljetus on juuri tämän molekyylin ominaisuus. Myös demetyloituneet sukulaisyhdisteet, kuten Azure B, ovat hapetus-pelkistysaktiivisia, mutta ne käyttäytyvät eri tavalla. Osittain hajonnut liuos tarkoittaa siis eri koetta kuin hajoamaton väriaine. Tämä on yksi syy vaatia täydellisten farmakopeavaatimusten täyttymistä ja julkaistua eräasiakirjaa pelkän metalliseulonnan sijaan. Valon käynnistämä kemia tuo vastaavan varauksen käyttötapoihin, joissa aine altistuu valolle. Sitä käsitellään punaiseen valoon yhdistämistä koskevassa artikkelissa.

Rajattu väite kestää kaiken tämän ja on säilyttämisen arvoinen: metyleenisininen voi toimia olosuhteista riippuvana elektronien kuriirina vaurioituneissa, eristetyissä mitokondrioissa ja säilyttää virtausta osittain peroksidin hinnalla. Kaikki tätä pidemmälle menevä — energia, pitkäikäisyys, korjaantuminen — odottaa näyttöä, jonka tuottamiseen näitä tutkimuksia ei koskaan suunniteltu.