آزمایش‌هایی که متیلن بلو را به تنفس سلولی پیوند دادند

خون انسانی که فیبرین آن جدا شده است، پس از سه ساعت گرم نگه داشتن در 37 °C، حدود دو درصد از اکسیژن خود را مصرف می‌کند. اگر پیش از انکوباسیون مقدار کمی متیلن بلو به آن اضافه شود، همان خون حدود شصت‌وپنج درصد از اکسیژن خود را مصرف می‌کند. هیچ چیز در سلول‌ها تغییر نکرده بود. فقط محلول تغییر کرده بود.

این عدد از مقاله‌ای در سال 1928 نوشتهٔ جورج هاروپ و ای. اس. گوسمان بارون در دانشگاه جانز هاپکینز آمده و منشأ این گزارهٔ بسیار تکرارشده است که متیلن بلو تنفس سلولی را بهبود می‌دهد. این گزاره نادرست نیست، اما معنای محدودتری از آنچه به نظر می‌رسد دارد.

عدد جدول واقعاً چه چیزی را اندازه می‌گیرد

شاخص نهایی، جذب اکسیژن بود که با تجزیهٔ گازها تعیین می‌شد. هاروپ و بارون خون تازه‌گرفته‌شده را در 10 °C از پنبه عبور دادند تا گلبول‌های سفید را حذف کنند، نمونه را با اکسیژن اشباع کردند، آن را تقسیم کردند، به یک بخش رنگ افزودند و پس از انکوباسیون هر دو بخش را تجزیه کردند. شمار گلبول‌های سفید به‌ندرت از حدود هزار در هر میلی‌متر مکعب بیشتر می‌شد. مصرف اکسیژن به‌صورت سهمی از اکسیژن اولیهٔ نمونه گزارش می‌شد که ناپدید شده بود.

آن‌ها دی‌اکسید کربن را هم اندازه گرفتند، اما در این مورد روش اندازه‌گیری دردسرساز شد. خون فاقد فیبرین در ساعت اول انکوباسیون، به دلایلی نامرتبط با واکنش مورد مطالعه، تا دو میلی‌مول دی‌اکسید کربن به‌ازای هر 100 mL آزاد می‌کرد؛ بنابراین ضرایب تنفسی به‌دست‌آمده از خون کامل قابل استفاده نبودند. فقط سلول‌های شسته‌شده در محلول لاک اعداد قابل تفسیر به دست می‌دادند و این اعداد، چه با رنگ و چه بدون آن، بین 0.73 و 0.80 قرار داشتند.

این جزئیات کم‌اهمیت نیست. «تنفس» در این مقاله‌ها به‌معنای تبادل گاز در یک ظرف بسته است. فاصلهٔ میان مصرف اکسیژن و تولید انرژی قابل استفاده، جداگانه در مقالهٔ مصرف اکسیژن دربارهٔ ATP چه چیزی را نشان می‌دهد و چه چیزی را نشان نمی‌دهد بررسی شده است.

رنگ بیشترین افزایش را در سلول‌هایی ایجاد کرد که کمترین تنفس را داشتند

گلبول‌های قرمز بالغ پستانداران تقریباً هیچ مصرف اکسیژن قابل اندازه‌گیری ندارند. گلبول‌های قرمز هسته‌دار پرندگان دارند. هاروپ و بارون هر دو را آزمایش کردند و این تفاوت، ستون اصلی استدلال آن‌هاست.

در نمونه‌های پستانداران، رنگ افزایش‌هایی بیست تا پنجاه برابر ایجاد کرد. در خون غاز، که سلول‌هایش از پیش تنفس داشتند، نرخ هرگز بیش از دو برابر نشد. هرچه تنفس اولیه بیشتر بود، رنگ افزایش کمتری ایجاد می‌کرد.

همین الگو درون یک گونه هم دیده می‌شود. یک نمونهٔ خون انسانی از بیمار مبتلا به پلی‌سیتمی ورا، که حاوی سلول‌های نابالغ بود، بدون رنگ 11.3 درصد از اکسیژن خود را مصرف کرد؛ در مقابل، سلول‌های شسته‌شدهٔ یک اهداکنندهٔ سالم 2.8 درصد را مصرف کردند. رنگ مصرف را فقط به 63.4 درصد رساند؛ افزایشی شش‌برابری، در حالی که سلول‌های طبیعی تقریباً سی برابر افزایش نشان دادند. رنگ رفتار سلول‌های بالغ را به رفتار سلول‌های نابالغ نزدیک کرد؛ همان کاری که به گفتهٔ نویسندگان انجام می‌داد.

سیانید باید آن را متوقف می‌کرد

می‌دانستند که سیانید اکسایش سلولی را متوقف می‌کند. بااین‌حال، هاروپ و بارون آن را همراه رنگ اضافه کردند.

نتایج خون گاو نمونه‌ای گویاست. بدون افزودن هیچ ماده‌ای، مقدار اکسیژن طی سه ساعت از 22.61 به 22.03 درصد حجمی کاهش یافت. با متیلن بلو به 12.84 رسید. با متیلن بلو و سیانید پتاسیم با غلظت یک پنج‌هزارم مولار، به 12.74 رسید. اثر رنگ عملاً دست‌نخورده باقی ماند.

شکل: ثبت پیوستهٔ میکروتنفس گلبول‌های قرمز انسان. پیکان زمان افزودن متیلن بلو را نشان می‌دهد. پیش از آن، منحنی تقریباً افقی است؛ پس از آن، پیوسته بالا می‌رود. بازنشر از هاروپ و بارون، مجلهٔ پزشکی تجربی 48:207–223 (1928)، PMID 19869478.

نتیجه‌گیری آن‌ها این بود که رنگ به‌عنوان حامل اکسیژن عمل می‌کند و «ماده‌ای را تأمین می‌کند که از گلبول‌های قرمز بی‌هستهٔ پستانداران بالغ ناپدید شده است». دو سال بعد، میکائلیس و سالومون در مؤسسهٔ راکفلر این اختلاف نظر را به صورتی ماندگار بیان کردند. یا اثر رنگ «ویژگی اتفاقی خود رنگ» بود، یا رنگ «مدلی برای ماده‌ای ناشناخته در جانداران» محسوب می‌شد. این دوگانگی هنوز حل نشده است. آنچه تغییر کرده، این است که اکنون می‌توان سلول‌ها را بسیار دقیق‌تر توصیف کرد.

عصارهٔ کبد هم همین کار را کرد

میکائلیس و سالومون نشان دادند که عصاره‌های اندام‌ها که با آب سرد تهیه می‌شوند، همین تحریک را ایجاد می‌کنند. کبد موش صحرایی قوی‌ترین اثر را داشت و پس از آن کلیه، طحال و بیضه قرار می‌گرفتند. مغز، عضله و سرم خون اثر اندکی داشتند یا بی‌اثر بودند.

سپس عصاره را در برابر مونوکسید کربن آزمودند. تنفسی که عصاره یا رنگ ایجاد می‌کرد، در مخلوطی از 98 درصد مونوکسید کربن و 2 درصد اکسیژن تغییر نکرد. همان مخلوط گازی، تنفس مخمر و گلبول‌های قرمز هسته‌دار ماکیان را حدود 60 تا 80 درصد مهار می‌کرد؛ مطابق با توصیف واربورگ از یک آنزیم تنفسی حساس به مونوکسید کربن. بنابراین، مادهٔ بافتی ناشناخته، آنزیم واربورگ نبود.

در طول بررسی، چند گزینهٔ احتمالی برای هویت این ماده کنار گذاشته شدند. گلوتاتیون احیاشده و سیستئین فقط به‌اندازهٔ لازم برای اکسایش خودشان مصرف اکسیژن ایجاد می‌کردند. کوآنزیم هاردن و یانگ رد شد، زیرا عضله بیشترین مقدار آن را دارد، اما تقریباً کمترین اثر را نشان داد. سیتوکروم کیلین، که چند سال پیش‌تر نام‌گذاری شده بود، با همان تناقض روبه‌رو شد. پیشنهاد خودشان، مبنی بر اینکه مادهٔ فعال از هستهٔ سلول می‌آید، را نیز صرفاً یک پیشنهاد خواندند.

اثر به شرایطی وابسته بود

سلول‌ها باید سالم و دست‌نخورده می‌بودند. همولیز با آب مقطر یا انجماد مکرر، پاسخ به رنگ و عصاره را از بین می‌برد و همولیز جزئی، پاسخ را به همان نسبت کاهش می‌داد.

وجود قند هم لازم بود. گلوکز، فروکتوز و ساکاروز از تنفس القاشده با رنگ پشتیبانی می‌کردند؛ مانیتول چنین نبود. بدون قند، هیچ تنفسی رخ نمی‌داد و به نظر می‌رسید رنگ در این فرایند به سلول‌ها آسیب می‌زند؛ بنابراین افزودن گلوکز یک یا دو ساعت بعد، تنفس را بازنمی‌گرداند. نویسندگان پیشنهاد کردند که رنگ یکی از اجزای ساختاری مورد نیاز سلول را اکسید می‌کند.

نور اثر رنگ را به‌طور قابل‌توجهی افزایش می‌داد، هرچند اثر در تاریکی هم آشکار بود. رنگ‌های احیاپذیر دیگر رفتار متفاوتی داشتند: تولوئیلن بلو اثری برابر یا بیشتر از متیلن بلو داشت، در حالی که ایندیگو دی‌سولفونات تقریباً بی‌اثر بود. رابطهٔ روشنی میان پتانسیل اکسایش‌ـ‌کاهش رنگ و اندازهٔ اثر آن دیده نشد؛ نویسندگان این موضوع را به نفوذپذیری غشا و سمیت نسبت دادند.

اثر با تخمیر همبستگی داشت، نه با تنفس

مطالعهٔ بارون در 1930 از سوسپانسیون‌های سلولی به برش‌های بافتی اندام‌های طبیعی موش صحرایی و تومورهای پیوندزده‌شده رفت.

در بافت‌های فاقد گلیکولیز هوازی، متیلن بلو بی‌اثر بود یا مصرف اکسیژن را اندکی کاهش می‌داد: در کلیه حدود 14 درصد، در لوزالمعده حدود 14 درصد و در کبد حدود 5 درصد. در بافت‌هایی که در حضور اکسیژن تخمیر می‌کنند، مصرف را افزایش می‌داد: در طحال حدود 8 درصد و در مغز حدود 13 درصد. افزایش در تومورها از حدود 27 درصد در کارسینوم پستان انسان تا بیش از 80 درصد در سارکوم روس در مرغ بود و تقریباً با میزان گلیکولیز هوازی هر بافت تناسب داشت.

شکل: هر نقطه یک نوع بافت است. محور افقی گلیکولیز هوازی و محور عمودی تغییر مصرف اکسیژن پس از افزودن متیلن بلو را نشان می‌دهد. داده‌ها از بارون، مجلهٔ پزشکی تجربی 52:447–456 (1930)، جدول 6، PMID 19869777.

سپس آزمایش سیانید، تصویر وارونه‌ای ایجاد کرد. وقتی تنفس در بافت‌هایی که پیش‌تر پاسخ نمی‌دادند با سیانید مسدود شد و تخمیر آشکار شد، رنگ دوباره مصرف اکسیژن را افزایش داد: در کلیه حدود 59 درصد، در کبد حدود 19 درصد، در طحال حدود 286 درصد و در بیضه حدود 200 درصد.

بارون پیشنهاد کرد که رنگ می‌تواند آزمونی برای توان تخمیری سلول یا بافت باشد و مقاله را با یک گمانه‌زنی به پایان رساند: شاید نسل‌های متوالی کشت تومور در محیط حاوی رنگ، روزی سوخت‌وساز تومور را به‌طور دائمی شبیه بافت طبیعی کند. این یک پرسش پژوهشی بود که در 1930 نوشته شد، نه یک ادعای درمانی.

آزمایش‌ها چه چیزی را نمی‌توانستند اندازه گرفته باشند

در 1928 و 1930، «تنفس» به‌معنای مصرف اکسیژن بود. آدنوزین تری‌فسفات نخستین‌بار در 1929 گزارش شد و اثبات اینکه میتوکندری‌های جداشده هم‌زمان با انتقال الکترون، فسفات را استری می‌کنند، در 1949 انجام شد. هیچ‌یک از مقاله‌های اولیهٔ متیلن بلو نمی‌توانست تولید انرژی را اندازه گرفته باشد و هیچ‌کدام نیز چنین ادعایی نکردند.

مشکل دوم، خود سلول‌هاست. گلبول‌های قرمز بالغ پستانداران میتوکندری ندارند. آن‌ها در مرحلهٔ رتیکولوسیت، میتوکندری‌ها و ریبوزوم‌ها را با اتوفاژی انتخابی حذف می‌کنند؛ به همین دلیل، گلبول قرمز بالغ انرژی خود را از گلیکولیز می‌گیرد و عمدتاً برای NADPH، نه ATP، به مسیر پنتوز فسفات وابسته است. در آزمایش‌های 1928 هیچ زنجیرهٔ انتقال الکترونی وجود نداشت که ترمیم شود. هر چیزی که اکسیژن را مصرف می‌کرد، کار دیگری انجام می‌داد.

اکنون آن کار دیگر تا حد نسبتاً خوبی توصیف شده است. متیلن بلو از معادل‌های احیاکنندهٔ سلولی الکترون می‌پذیرد و به لوکومتیلن بلو تبدیل می‌شود؛ سپس اکسیژن مولکولی آن را دوباره اکسید می‌کند و چرخه کامل می‌شود. در گلبول‌های قرمز انسان، فلاوین ردوکتاز وابسته به NADPH و دی‌سولفید ردوکتازهای مرتبط، مرحلهٔ احیا را انجام می‌دهند. مطالعه‌ای در 1976 با استفاده از گلوکز نشان‌دار دریافت که رنگ، مسیر فرعی هگزوز مونوفسفات را تحریک می‌کند؛ اثر در غلظت پایین به اکسی‌هموگلوبین وابسته بود و غلظت بالاتر، یعنی 0.1 mM، پراکسید هیدروژن تولید می‌کرد. رنگ احیاشده در برخورد با اکسیژن، پراکسید تولید می‌کند، نه پیوندهای فسفات.

در میتوکندری‌ها، تصویر بیش از آنچه خلاصه‌های رایج نشان می‌دهند محل اختلاف است. یک مسیر پژوهشی بر این نظر است که رنگ، الکترون‌ها را از ناحیهٔ کمپلکس I می‌گیرد و به سیتوکروم c می‌دهد. مسیر دیگری دریافت که در میتوکندری‌های مغز موش، رنگ نمی‌تواند تنفس را پس از مهار با آنتی‌مایسین بازگرداند و در عوض، پذیرندهٔ الکترون را در جایگاه اتصال یوبی‌کینول در کمپلکس III قرار داد. مسیر سوم دریافت که غلظت‌های پایین، مصرف اکسیژن در حالت استراحت را افزایش می‌دهند، بی‌آنکه تنفس تحریک‌شده با ADP را تغییر دهند. صریح‌ترین بیان این نکته آن است که مصرف اکسیژن القاشده با متیلن بلو اصلاً به فسفریلاسیون اکسیداتیو وابسته نیست: این مصرف هم هنگام مهار زنجیرهٔ تنفسی و هم در نمونه‌های فاقد چنین زنجیره‌ای ادامه داشت.

اندازه‌گیری‌های مستقیمی از فاصلهٔ میان این دو کمیت نیز وجود دارد. در میتوکندری‌های جداشدهٔ کبد موش صحرایی، افزایش غلظت رنگ، نسبت‌های کنترل تنفسی را کاهش داد و باعث تورم شد؛ نویسندگان این پدیده را جداشدن جفت‌شدگی فسفریلاسیون اکسیداتیو توصیف کردند. در کبد پرفیوژن‌شدهٔ موش صحرایی، متیلن بلو مصرف اکسیژن را افزایش داد، در حالی که نسبت ATP به ADP کاهش یافت.

شواهد بالینی نیز همین پیام را دارند. متهموگلوبینمی با حدود یک تا دو میلی‌گرم متیلن بلو به‌ازای هر کیلوگرم، از راه وریدی و از طریق یک مسیر احیای وابسته به NADPH درمان می‌شود؛ دوزهای بالاتر همان وضعیتی را ایجاد می‌کنند که قرار است درمان شود. همان مقالهٔ مروری اشاره می‌کند که اثر پادزهری در گلبول‌های قرمز سالم بیشترین مقدار را دارد و در حضور همولیز کاهش می‌یابد؛ این همان یافتهٔ همولیز در 1930 است که هفتادوسه سال بعد در محیط بیمارستان دوباره ظاهر می‌شود. دوز ترکیبی که اثرات مفید و زیان‌آورش در دو سوی یک آستانهٔ دوز قرار دارند، نباید از اندازه‌گیری مصرف اکسیژن استنباط شود.

چرا بچ تولید باید در این بحث باشد

هاروپ و بارون متوجه نکته‌ای شدند که ارزش بازخوانی دارد. خود متیلن بلو در طیف‌نما نواری میان دو نوار مشخصهٔ متهموگلوبین ایجاد می‌کند که «در بررسی سطحی به‌آسانی می‌تواند باعث اشتباه شود». رنگ می‌تواند شبیه ماده‌ای به نظر برسد که به‌دنبال آن هستیم.

همین مشکل صورت شیمیایی هم دارد. یک فنوتیازین مرتبط که به‌عنوان جزء کم‌مقدار حضور دارد، رفتار اکسایش‌ـ‌کاهش، نفوذپذیری و سمیت خاص خود را دارد. یک مورد مستند، اهمیت موضوع را ملموس می‌کند: در مطالعه‌ای دربارهٔ یددار کردن متیلن بلو، نمونه‌های حاوی حدود 7 تا 8 درصد Azure B، عمدتاً Azure B یددارشده تولید کردند؛ بنابراین ناخالصی، نه متیلن بلو، بر واکنش غالب بود.

هر کسی که از متیلن بلو به‌عنوان معرف در آزمایشگاه، روی میز رنگ‌آمیزی یا در آکواریوم استفاده می‌کند، تا زمانی که بچ تولید مشخصه‌یابی نشده باشد، با ماده‌ای با مشخصات نامعلوم کار می‌کند. مواد مرتبط، هویت، ناخالصی‌های عنصری، حلال‌های باقی‌مانده و باقی‌مانده پس از سوزاندن، بخشی از خود آزمایش‌اند، نه صرفاً مدارک جانبی آن. Blupreme متیلن بلو خود را از یک تولیدکنندهٔ دارویی تهیه می‌کند و گواهی آنالیز کامل منتشر می‌کند که تمام مشخصات USP را می‌آزماید، نه فقط فلزات سنگین را؛ راهنمای خواندن گواهی آنالیز و عنوان گرید USP چه چیزی را تأیید می‌کند و چه چیزی را تأیید نمی‌کند توضیح می‌دهند که چگونه سند را با ادعا تطبیق دهید.

عدد درست بود

آزمایش‌های 1928 و 1930 با دقت انجام شدند و مشاهدهٔ اصلی آن‌ها همچنان پابرجاست: یک رنگ احیاپذیر می‌تواند سلولی را که تقریباً تنفس نمی‌کند وادارد اکسیژن را با نرخی چندین برابر حالت استراحت مصرف کند، بی‌آنکه از مرحله‌ای عبور کند که سیانید آن را مسدود می‌کند.

اشتباه بعداً رخ می‌دهد، وقتی «تنفس» با معنای امروزی‌اش خوانده می‌شود. اندازه‌گیری تبادل گاز به شما می‌گوید که الکترون‌ها به اکسیژن رسیده‌اند. نمی‌گوید هیچ‌یک از آن‌ها برای ساخت ATP به کار رفته‌اند؛ و در سلولی بدون میتوکندری، فاصلهٔ میان این دو گزاره به بیشترین حد ممکن می‌رسد. نقشهٔ گسترده‌تر عملکرد متیلن بلو در سلول‌ها همین تمایز را در چارچوبی وسیع‌تر قرار می‌دهد و تاریخچهٔ این ترکیب، از رنگ تا دارو توضیح می‌دهد که یک رنگ نساجی چگونه در وهلهٔ اول به این آزمایش‌ها راه یافت.