Metileno urdina arnasketa zelularrarekin lotu zuten esperimentuak

Giza odol desfibrinatuak, hiru orduz 37 °C-an berotuta, daukan oxigenoaren ehuneko bi inguru kontsumitzen du. Inkubazioaren aurretik metileno urdin kantitate txiki bat gehituz gero, odol berak ehuneko hirurogeita bost inguru kontsumitzen du. Zeluletan ez zen ezer aldatu. Disoluzioan bakarrik.

Datu hori George Harropek eta E. S. Guzman Barronek Johns Hopkinsen 1928an argitaratutako artikulu batetik dator, eta metileno urdinak arnasketa zelularra hobetzen duela dioen baieztapen zabalduaren jatorria da. Baieztapena ez da faltsua, baina dirudiena baino esanahi mugatuagoa du.

Taulako zenbakiak benetan zer neurtzen duen

Neurtutako azken parametroa oxigenoaren hartzea izan zen, gas-analisiz zehaztua. Harropek eta Barronek atera berriko odola kotoizko iragazki batetik pasarazi zuten 10 °C-an, globulu zuriak kentzeko; lagina oxigenoz saturatu, zatitu, zati bati tindagaia gehitu eta biak analizatu zituzten inkubazioaren ondoren. Leukozito kopurua oso gutxitan zen mila ingurutik gorakoa milimetro kubikoko. Oxigeno-kontsumoa laginak hasieran zuen oxigenoaren zer proportzio desagertu zen adieraziz eman zuten.

Karbono dioxidoa ere neurtu zuten, eta hor metodoak oztopoak jarri zizkien. Odol desfibrinatuak bi milimol karbono dioxido askatzen zituen gehienez 100 mL-ko inkubazioaren lehen orduan, aztergai zen erreakzioarekin zerikusirik ez zuten arrazoiengatik; beraz, odol osoaren arnas kozienteak ezin ziren erabili. Locke-ren disoluzioan zeuden zelula garbituek bakarrik eman zituzten interpretatzeko moduko datuak, eta 0.73 eta 0.80 artean bildu ziren, tindagaiarekin nahiz gabe.

Xehetasun hori ez da hutsala. Artikulu horietan, «arnasketa» ontzi itxi bateko gas-trukea da. Oxigeno-kontsumoaren eta energia erabilgarriaren ekoizpenaren arteko aldea beste artikulu batean aztertzen da: oxigeno-kontsumoak ATPaz zer esaten dizun eta zer ez.

Tindagaiak gehien handitu zuen kontsumoa zelulek gutxien arnasten zuten tokietan

Ugaztunen eritrozito helduek ia ez dute oxigeno-kontsumo neurgarririk. Hegaztien eritrozito nukleodunek, bai. Harropek eta Barronek biak probatu zituzten, eta bien arteko kontrastea da haien argudioaren ardatza.

Ugaztunen laginetan, tindagaiak kontsumoa hogei eta berrogeita hamar aldiz artean handitu zuen. Antzararen odolean, zeinaren zelulek jada arnasten baitzuten, ez zuen inoiz tasa bikoitza baino gehiago handitu. Hasierako arnasketa zenbat eta handiagoa izan, orduan eta gutxiago gehitu zezakeen tindagaiak.

Espezie beraren barruan ere gradiente bera agertzen da. Polizitemia vera zuen paziente baten giza lagin batek, zelula heldugabeak zituenak, oxigenoaren ehuneko 11.3 kontsumitu zuen tindagairik gabe; emaile osasuntsu baten zelula garbituek, berriz, ehuneko 2.8. Tindagaiak ehuneko 63.4raino baino ez zuen igo: sei aldiz bizkortu zuen prozesua, zelula normaletan ia hogeita hamar aldiz bizkortzen zen bitartean. Tindagaiak zelula helduen portaera zelula heldugabeenaren antzekoagoa bihurtu zuen, egileek egiten zuela esan zuten bezala.

Zianuroak eten egin behar zuen

Jakina zen zianuroak oxidazio zelularra eteten zuela. Harropek eta Barronek gehitu egin zuten hala ere, tindagaiarekin batera.

Behi-odolaren emaitzak adierazgarriak dira. Ezer gehitu gabe, oxigeno-edukia ehuneko 22.61 bolumenetik 22.03ra jaitsi zen hiru ordutan. Metileno urdinarekin, 12.84ra jaitsi zen. Metileno urdinarekin eta potasio zianuroaren bost milaren bateko kontzentrazio molarrarekin, 12.74ra jaitsi zen. Tindagaiaren efektua ia ez zen aldatu.

Irudia: giza eritrozitoen mikroarnasketaren etengabeko erregistroa. Geziak metileno urdina gehitu zen unea adierazten du. Aurretik, kurba ia laua da; ondoren, etengabe igotzen da. Harrop eta Barronen lanetik erreproduzitua, Journal of Experimental Medicine 48:207–223 (1928), PMID 19869478.

Haien ondorioa izan zen tindagaiak oxigeno-eramaile gisa jarduten zuela, «ugaztun helduen eritrozito nukleogabeetatik desagertu den substantzia bat emanez». Bi urte geroago, Rockefeller Institutuko Michaelisek eta Salomonek eztabaidari behin betiko forma eman zioten. Edo tindagaiaren efektua «tindagaiaren ustekabeko propietate bat» zen, edo tindagaia «organismoetako substantzia ezezagunen baten eredua» zen. Bi aukera horien arteko auzia ez da argitu. Aldatu dena da orain zelulak askoz zehatzago deskriba daitezkeela.

Gibel-estraktu batek gauza bera egin zuen

Michaelisek eta Salomonek erakutsi zuten organoen ur hotzeko estraktuek estimulazio bera eragiten dutela. Arratoiaren gibela izan zen indartsuena, eta ondoren giltzurruna, barea eta barrabila. Garunak, muskuluak eta odol-serumak efektu txikia zuten, edo batere ez.

Gero, karbono monoxidoaren aurrean probatu zuten estraktua. Estraktuak nahiz tindagaiak eragindako arnasketa ez zen aldatu ehuneko 98 karbono monoxido eta ehuneko 2 oxigeno zituen nahaste batean. Gas-nahaste berak legamiaren eta hegaztien eritrozito nukleodunen arnasketa ehuneko 60 eta 80 artean inhibitu zuen gutxi gorabehera, Warburgek karbono monoxidoarekiko sentikorra den arnas fermentu bati buruz emandako azalpenarekin bat etorriz. Identifikatu gabeko ehun-substantzia, beraz, ez zen Warburgen entzima.

Bidean, hainbat hautagai baztertu ziren. Glutation erreduzituak eta zisteinak beren oxidazioak behar zuen oxigeno-kontsumoa baino ez zuten eragin. Harden eta Youngen koentzima baztertu zuten, muskuluak baitauka haren kantitaterik handiena eta ia efekturik txikiena erakutsi baitzuen. Urte batzuk lehenago izendatutako Keilinen zitokromoak kontraesan bera izan zuen. Haien proposamenari berari —substantzia aktiboa zelularen nukleotik zetorrela— iradokizun hutsa deitu zioten.

Efektuak baldintzak zituen

Zelulek osorik egon behar zuten. Ur destilatuak edo behin eta berriz izozteak eragindako hemolisiak tindagaiaren nahiz estraktuaren aurreko erantzuna ezabatu zuen, eta hemolisi partzialak proportzionalki murriztu zuen.

Azukrea ere beharrezkoa zen. Glukosak, fruktosak eta sakarosak tindagaiak eragindako arnasketa ahalbidetu zuten; manitolak ez. Azukrerik gabe ez zegoen arnasketarik, eta bazirudien tindagaiak zelulak kaltetzen zituela prozesuan; beraz, ordu bat edo bi geroago gehitutako glukosak ez zuen arnasketa berrezarri. Egileek iradoki zuten tindagaia zelulak behar zuen egiturazko osagai bat oxidatzen ari zela.

Argiztapenak nabarmen handitu zuen tindagaiaren efektua, nahiz eta ilunpean ere efektua argia izan. Beste tindagai erreduzigarri batzuek bestelako portaera izan zuten: toluileno urdinak metileno urdinaren efektua berdindu edo gainditu zuen; indigo disulfonatoak, aldiz, ia ez zuen ezer egin. Ez zen erlazio argirik agertu tindagai baten oxidazio-erredukzio potentzialaren eta haren efektuaren tamainaren artean; egileek mintzaren iragazkortasunari eta toxikotasunari egotzi zioten hori.

Efektua hartzidurarekin lotzen zen, ez arnasketarekin

Barronen 1930eko azterketa zelula-esekiduretatik arratoien organo normalen eta transplantatutako tumoreen ehun-xerretara igaro zen.

Glikolisi aerobikorik gabeko ehunetan, metileno urdinak ez zuen ezer egin edo oxigeno-kontsumoa apur bat murriztu zuen: giltzurrunean ehuneko 14 inguru, pankrean ehuneko 14 inguru eta gibelean ehuneko 5 inguru. Oxigenoaren presentzian hartzidura egiten duten ehunetan, kontsumoa handitu zuen: barean ehuneko 8 inguru eta garunean ehuneko 13 inguru. Tumoreetako igoerak giza bularreko kartzinoma baten ehuneko 27 ingurutik Rous-en oilasko-sarkoma baten ehuneko 80tik gorako baliora bitartekoak izan ziren, ehun bakoitzaren glikolisi aerobikoarekiko proportzioan gutxi gorabehera.

Irudia: puntu bakoitza ehun mota bat da. Ardatz horizontala glikolisi aerobikoa da; ardatz bertikala, metileno urdina gehitu ondorengo oxigeno-kontsumoaren aldaketa. Barronen datuak, Journal of Experimental Medicine 52:447–456 (1930), 6. taula, PMID 19869777.

Ondoren, zianuroarekin egindako esperimentuak alderantzizko irudia eman zuen. Lehen erantzuten ez zuten ehun horien arnasketa zianuroz blokeatu eta hartzidura agerian geratu zenean, tindagaiak oxigeno-kontsumoa handitu zuen berriz: giltzurrunean ehuneko 59 inguru, gibelean ehuneko 19 inguru, barean ehuneko 286 inguru eta barrabilean ehuneko 200 inguru.

Barronek proposatu zuen tindagaia zelula edo ehun baten hartzidura-ahalmena probatzeko erabil zitekeela, eta espekulazio batekin amaitu zuen: tumore bat tindagaia zuen ingurune batean belaunaldiz belaunaldi hazteak, agian, egunen batean tumorearen metabolismoa ehun normalaren antzekoa bihur zezakeen behin betiko. 1930ean idatzitako ikerketa-galdera bat zen hori. Ez da tratamenduari buruzko baieztapen bat.

Esperimentuek neurtu ezin zutena

1928an eta 1930ean, «arnasketa» oxigeno-kontsumoa zen. Adenosina trifosfatoaren berri 1929an eman zen lehen aldiz, eta mitokondria isolatuek elektroiak transferitu bitartean fosfatoa esterifikatzen dutela 1949an frogatu zen. Metileno urdinari buruzko lehen artikulu haietako bakar batek ere ezin izan zuen energia-ekoizpena neurtu, eta batek ere ez zuen hori egin zuenik esan.

Zelulak dira bigarren arazoa. Ugaztunen eritrozito helduek ez dute mitokondriarik. Erretikulozitoaren fasean, mitokondriak eta erribosomak ezabatzen dituzte autofagia selektiboaren bidez; horregatik, globulu gorri heldu batek glikolisia erabiltzen du, eta pentosa fosfatoen bidearen mende dago nagusiki NADPHa lortzeko, ez ATPa. 1928ko esperimentuetan ez zegoen konpontzeko elektroi-garraio katerik. Oxigenoa kontsumitzen zuenak beste zerbait egiten zuen.

Beste zerbait hori zer zen nahiko ondo deskribatuta dago orain. Metileno urdinak zelulako baliokide erreduzitzaileetatik elektroiak hartzen ditu eta leukometileno urdin bihurtzen da; oxigeno molekularrak berriz oxidatzen du azken hori, zikloa itxiz. Giza globulu gorrietan, NADPHaren mendeko flabina erreduktasak eta hari lotutako disulfuro erreduktasek egiten dute erredukzio-urratsa. Glukosa markatua erabili zuen 1976ko azterketa batek aurkitu zuen tindagaiak hexosa monofosfatoaren bidea estimulatzen duela, kontzentrazio baxuko efektua oxihemoglobinaren mende zegoela eta kontzentrazio handiago batek, 0.1 mM-koak, hidrogeno peroxidoa sortzen zuela. Tindagai erreduzitu batek oxigenoarekin topo egitean peroxidoa sortzen du, ez fosfato-loturak.

Mitokondrietan, egoera azalpen dibulgatzaileek onartzen dutena baino eztabaidatuagoa da. Ikerketa-ildo batek dio tindagaiak I konplexuaren ingurutik hartzen dituela elektroiak eta c zitokromoari ematen dizkiola. Beste batek aurkitu zuen saguaren garuneko mitokondrietan ezin duela arnasketa berrezarri antimizina bidezko blokeo baten ondoren, eta elektroi-hartzailea III konplexuaren ubikinolari lotzeko gunean kokatu zuen. Hirugarren batek aurkitu zuen kontzentrazio baxuek atsedeneko oxigeno-kontsumoa handitzen zutela, ADPak estimulatutako arnasketa aldatu gabe. Kontuaren adierazpen zuzenena da metileno urdinak eragindako oxigeno-kontsumoa ez dagoela batere fosforilazio oxidatiboaren mende: mantendu egin zen arnas katea inhibituta zegoenean, baita arnas katerik gabeko prestakinetan ere.

Bi magnitudeen arteko aldearen neurketa zuzenak ere badaude. Arratoiaren gibeleko mitokondria isolatuetan, tindagaiaren kontzentrazioa handitzeak arnas kontrolaren ratioak jaitsi eta hantura eragin zuen; egileek fosforilazio oxidatiboaren desakoplamendua deitu zioten horri. Arratoiaren gibel perfundituan, metileno urdinak oxigeno-kontsumoa handitu zuen, ATP/ADP ratioa jaitsi bitartean.

Ebidentzia klinikoak mezu bera ematen du. Methemoglobinemia gutxi gorabehera kilogramoko miligramo bat edo bi metileno urdin zain barnetik emanez tratatzen da, NADPHaren mendeko erredukzio-bide baten bidez, eta dosi handiagoek tratatu nahi den egoera bera eragiten dute. Berrikuspen berak dio antidoto-efektua handiena dela eritrozito osoetan eta txikiagoa hemolisia dagoenean; 1930eko hemolisiari buruzko aurkikuntza bera da, hirurogeita hamahiru urte geroago ospitaleko testuinguruan berragertua. Efektu erabilgarriak eta kaltegarriak dosi-atalase baten alde banatan dituen konposatu baten dosia ez litzateke oxigeno-kontsumoaren neurketa batetik ondorioztatu behar.

Zergatik den sorta eztabaidaren parte

Harropek eta Barronek bigarren irakurketa bat merezi duen zerbait nabaritu zuten. Metileno urdinak berak banda bat sortzen du espektroskopioan methemoglobinaren bi banda bereizgarrien artean, «azaleko ikuskapen batean erraz nahasmena eragin dezakeena». Tindagaiak bilatzen ari den substantziaren itxura har dezake.

Arazo berak forma kimikoa ere badu. Osagai minoritario gisa agertzen den fenotiazina ahaide batek berezko erredox-portaera, iragazkortasuna eta toxikotasuna ditu. Dokumentatutako kasu batek argi erakusten du zer dagoen jokoan: metileno urdinaren iodazioari buruzko azterketa batean, ehuneko 7 eta 8 artean Azure B zuten laginek batez ere Azure B iodatua sortu zuten; beraz, ezpurutasuna nagusitu zen erreakzioan, metileno urdina beharrean.

Metileno urdina erreaktibo gisa erabiltzen duen edonor, laborategi batean, tindaketa-mahai batean edo akuario batean, zehaztu gabeko osagai batekin ari da lanean, sorta karakterizatu ez bada. Erlazionatutako substantziak, identitatea, ezpurutasun elementalak, hondar-disolbatzaileak eta ignizio-hondarra esperimentuaren parte dira, ez haren inguruko izapide hutsak. Blupremek farmazia-fabrikatzaile batengandik lortzen du metileno urdina eta analisi-ziurtagiri oso bat argitaratzen du, USP espezifikazio osoa egiaztatuz, ez metal astunak bakarrik; analisi-ziurtagiri bat irakurtzeko gidak eta USP graduko izendapenak zer egiaztatzen duen eta zer ez azaltzen duen artikuluak dokumentua baieztatutakoarekin nola alderatu azaltzen dute.

Zenbakia zuzena zen

1928ko eta 1930eko esperimentuak arretaz egin ziren, eta haien behaketa nagusiak indarrean dirau: tindagai erreduzigarri batek ia arnasten ez duen zelula bat atsedeneko tasaren halako askoz oxigeno gehiago kontsumitzera bultza dezake, zianuroak blokeatzen duen urratsetik igaro gabe.

Akatsa geroago agertzen da, «arnasketa» gaur egungo esanahiarekin irakurtzen denean. Gas-trukearen neurketa batek elektroiak oxigenora iritsi zirela esaten dizu. Ez dizu esaten haietako bakar bat ere ATPa egiteko erabili zenik, eta mitokondriarik gabeko zelula batean bi baieztapen horien arteko tartea ahalik eta handiena da. Metileno urdinak zeluletan egiten duenaren mapa zabalagoak bereizketa bera testuinguru zabalago batean kokatzen du, eta konposatuaren historiak, tindagaitik sendagaira, ehungintzako koloratzaile bat esperimentu horietara nola iritsi zen azaltzen du.