Metilensko plavo i mitohondrije: transport elektrona i dokazi

Zamislite dva preparata jedan pored drugog. Oba sadrže mitohondrije mozga otrovane rotenonom, hemikalijom koja blokira kompleks I respiratornog lanca. U jedan preparat istraživač pipetom dodaje mikromolarnu dozu metilenskog plavog. Potrošnja kisika djelimično se oporavlja. Membranski potencijal djelimično se vraća. Ponovo počinje sinteza male količine ATP-a. U susjednoj kiveti senzor peroksida pokazuje drugu polovinu priče: stvaranje vodikovog peroksida višestruko se povećalo, pri svakoj ispitanoj dozi i sa svakim isprobanim supstratom.

Oba očitanja su tačna. Metilensko plavo je prenosilac elektrona koji može održavati njihov tok zaobilazeći oštećeni dio respiratornog lanca, a isti taj prijenos ima cijenu u obliku peroksida. Kada se obje činjenice uzmu u obzir istovremeno, literatura o utjecaju metilenskog plavog na mitohondrijsku funkciju postaje razumljiva. Ako se uzme u obzir samo jedna, literatura djeluje kao priča o čudu ili prijetnji, zavisno od toga koji ste rad prvo otvorili.

Prijenos elektrona, jednostavno objašnjen

Respiratorni lanac je niz uzastopnih predaja elektrona. Elektroni ulaze na kompleksu I (iz NADH) ili na kompleksu II i srodnim flavinskim enzimima (iz sukcinata i sličnih donora), prolaze kroz kompleks III do pokretnog prenosioca citohroma c, a zatim kroz kompleks IV do kisika. Svaka predaja pumpa protone preko unutrašnje membrane, a nastali gradijent pokreće sintezu ATP-a. Blokirajte bilo koju stanicu i tok prije nje staje.

Metilensko plavo uključuje se kao paralelni prenosilac. Njegov oksidovani oblik preuzima elektrone od prethodnih prenosilaca i prelazi u bezbojni redukovani oblik, leukometilensko plavo, koji zatim predaje te elektrone dalje u lancu i ponovo postaje plav. Ta dva oblika opisana su u objašnjenju redoks-para, a šire ponašanje ovog prijenosa obrađeno je u općem objašnjenju mehanizma. Otvoreno pitanje je gdje se prenosilac ponovo uključuje u lanac: u veznom džepu za kinol na kompleksu III, poznatom kao Qo mjesto, ili direktno na citohromu c. Koji izlaz prevladava zavisi od uslova, što analiza zaobilaženja kompleksa III detaljno objašnjava.

Šta su tri studije na glodarima zaista mjerile

Sve tri studije koristile su izolovane mitohondrije mozga, odnosno organele izvađene iz ćelije i suspendovane u definisanom puferu. Nije bilo cijelih ćelija, životinja kojima je davana doza ni ljudskih ispitanika. Koncentracije se odnose na okolni rastvor u kojem se nalaze organele, a ne na oralnu dozu za čovjeka. U tom okviru brojevi jasno govore.

Prva studija, na izolovanim mitohondrijama mozga zamorca pri koncentracijama od 100 nanomolarnih do 2 mikromolarne, utvrdila je i korist i cijenu u istom preparatu. U zdravim mitohondrijama boja je povećala potrošnju kisika u mirovanju, ali nije promijenila respiraciju stimulisanu ADP-om, pa se proizvodnja ATP-a spregnuta s respiracijom nije poboljšala. Pri blokadi kompleksa I, koncentracija od 2 mikromolarne obnovila je sintezu ATP-a sa 46 na 93 nanomola u minuti po miligramu, naspram normalne brzine od približno 1109. Pri blokadi kompleksa III, ista doza povećala je proizvodnju ATP-a s oko 46 na 63, naspram normalne brzine od približno 910. Membranski potencijal i unos kalcija djelimično su se oporavili. Blokadu kompleksa IV cijanidom nije bilo moguće zaobići, što korisni izlaz elektrona smješta prije funkcionalnog kompleksa IV. Svako obnavljanje funkcije bilo je statistički potvrđeno i malo: jednocifreni procenti normalne proizvodnje ATP-a.

Druga studija, na mitohondrijama moždane kore miša pri koncentraciji od oko 1 mikromolarne, potvrdila je zaobilaženje kompleksa I i utvrdila granicu na kompleksu III. Rotenon je smanjio respiraciju s oko 121 na manje od 2 nanomola kisika u minuti po miligramu, a boja ju je povećala na oko 21, približno jednu šestinu normalne vrijednosti, dok se membranski potencijal gotovo potpuno oporavio. Međutim, nakon blokade kompleksa III, ni respiracija ni membranski potencijal nisu se oporavili u rasponu od 1 do 5 mikromolarnih, a blokada je potisnula signal peroksida izazvan bojom. Autori su predložili da redukovana boja predaje svoje elektrone na Qo mjestu kompleksa III: kada je to mjesto zauzeto, prenosilac ih nema gdje predati.

Treća studija, na mitohondrijama mozga miša, štakora i zamorca, uglavnom pri koncentraciji od 2 mikromolarne, direktno je ispitala neslaganje i utvrdila da se blokada kompleksa III može premostiti. Kada je inhibitor Qo mjesta miksotiazol smanjio bazalnu respiraciju za 88 posto, boja je obnovila potrošnju kisika na oko 62 posto vrijednosti bez blokade. U direktnom testu, koncentracija od pola mikromolarne redukovala je egzogeni citohrom c čak i dok je kompleks III bio blokiran, što podržava put od NADH preko boje do citohroma c i dalje do kompleksa IV. Međutim, obnovljena respiracija ponašala se abnormalno: dodani ADP smanjio je potrošnju kisika umjesto da je poveća, a blokiranje sinteze ATP-a stimulisalo je respiraciju. Membrana se samo djelimično repolarizovala. Visoka potrošnja kisika uz obrnutu spregu nije normalna proizvodnja energije.

Zašto se laboratorije ne slažu i šta razrješava neslaganje

Objašnjenje zasnovano na razlikama među vrstama prvo otpada. Treća grupa ponovila je rad na tri vrste glodara i kod svih dobila kvalitativno isto zaobilaženje, uključujući soj miša kod kojeg je ranije prijavljeno da zaobilaženja nema. Razlikuju se koncentracija (1 naspram 2 mikromolarne), doze inhibitora, puferi, metode izolacije i, prije svega, energetsko stanje koje se poredi: zaobilaženje je najjasnije prije dodavanja ADP-a, upravo kada se pojavljuje paradoksalni odgovor na ADP. Vjerodostojan dijagram zato prikazuje dva izlaza zavisna od uslova, jedan na Qo mjestu i drugi na citohromu c. Prenosilac predaje elektrone tamo gdje mu lokalna hemija to dopušta.

Cijena u obliku peroksida

Nalazi o cijeni jednako su dosljedni kao i nalazi o obnavljanju funkcije. U radu na zamorcima boja je povećala oslobađanje peroksida u svim ispitanim uslovima, u mirovanju, tokom sinteze ATP-a i pri hemijskom oštećenju, sa sva tri supstrata. Tokom sinteze ATP-a, stvaranje peroksida poraslo je s oko 148 na više od 1500 pikomola u minuti po miligramu pri koncentraciji od 1 mikromolarne, a čak je i koncentracija od 100 nanomolarnih povećala signal više od četiri puta. Boja je također usporila uklanjanje peroksida približno 2.6 puta, pa signal odražava brže stvaranje i sporije uklanjanje. Predloženi hemijski mehanizam je direktna redukcija kisika redukovanom bojom bez detektabilnog superoksida, iako to ostaje tumačenje, a ne dokazan korak.

Rad na miševima korisno usložnjava sliku. Peroksid je naglo rastao s dozom, od početne vrijednosti od približno 76 do gotovo 2000 pikomola u minuti po miligramu pri koncentraciji od 2 mikromolarne, ali je blokada kompleksa III potisnula komponentu izazvanu bojom. Kada bi peroksid nastajao samo reakcijom redukovane boje s kisikom, blokiranje lanca ne bi trebalo imati toliki značaj. Ipak ga ima, što znači da lanac učestvuje. Pregled antioksidativnog i prooksidativnog djelovanja smješta ovu dvojnost u širi kontekst, a analiza kisika naspram ATP-a objašnjava zašto same vrijednosti kisika nikada nisu dovoljne da potvrde tvrdnju o energiji.

Obnavljanje funkcije nije popravak

Izraz koji treba prestati koristiti glasi: „popravlja li metilensko plavo mitohondrije“. Popravak bi značio trajnu korekciju: obnovljene komplekse, spregu koja opstaje nakon što lijek nestane, oporavak u cijelim ćelijama, a zatim poboljšanu funkciju u živom organizmu. Nijedan od tri rada to ne pokazuje. Oni pokazuju akutno preusmjeravanje u svježe izolovanim organelama tokom vještačke hemijske blokade, uz proizvodnju ATP-a koja iznosi mali dio normalne vrijednosti i ponekad izrazito neobičnu spregu. Rotenon i antimicin su laboratorijski alati, a ne modeli starenja ili ljudskih mitohondrijskih bolesti, i ništa od ovoga ne znači više energije za zdravu osobu. To je zasebno pitanje dokaza s vlastitom literaturom o istraživanjima na ljudima.

Tri ograničenja omogućavaju vjerodostojan zaključak o biohakingu. Prvo, koncentracija u okolnom rastvoru nije doza: raspon od 0.1 do 2 mikromolarne oko izolovanih organela ne govori ništa o tome koja oralna količina stvara tu slobodnu koncentraciju u mitohondriji ljudskog mozga, naročito zato što se boja nakuplja ili oslobađa zavisno od samog membranskog potencijala. Drugo, kisik nije energija: boja može povećati potrošnju kisika cikličkim reakcijama i curenjem elektrona, kao i produktivnom fosforilacijom, pa respirometrija bez očitanja ATP-a i membranskog potencijala ne može opravdati tvrdnju o energiji. Treće, korist i opterećenje pripadaju istoj rečenici: svaka tvrdnja o obnovljenom membranskom potencijalu ili proizvodnji ATP-a koja izostavlja istovremeni porast peroksida pogrešno prikazuje eksperiment. Povezana ograničenja obuhvataju redoks-ravnotežu NAD-a, oblik odnosa doze i odgovora i vodič za ispitivanja.

Jedna praktična napomena: prijenos elektrona je svojstvo tačno određene molekule. Demetilovani srodni spojevi, poput Azure B, također su redoks-aktivni, ali se ponašaju drugačije, pa je djelimično razgrađen rastvor drugačiji eksperiment od eksperimenta s nerazgrađenom bojom. To je jedan od razloga da se insistira na punoj farmakopejskoj specifikaciji i objavljenom dokumentu za seriju, umjesto na provjeri samo metala. Hemijske reakcije pokrenute svjetlošću donose dodatno ograničenje za primjene uz osvjetljenje, obrađeno u tekstu o kombinacijama s crvenim svjetlom.

Usko definisana tvrdnja ostaje održiva uprkos svemu ovome i vrijedi je zadržati: metilensko plavo može, pod određenim uslovima, djelovati kao prenosilac elektrona u oštećenim izolovanim mitohondrijama, djelimično održavajući tok uz cijenu u obliku peroksida. Sve izvan toga, energija, dugovječnost, popravak, čeka dokaze koje ove studije nikada nisu bile osmišljene da pruže.