Historija metilenskog plavila: od boje do lijeka i istraživanja

Metilensko plavilo stiglo je do pacijenta prije nego što je stiglo do apoteke.

Izvještaj Paula Guttmanna i Paula Ehrlicha iz 1891. o upotrebi ove boje kod malarije sadrži dva grafikona temperature. Drugi obuhvata period od 13. jula do 5. augusta, s terapijom ispisanom uz rub za svaki dan. Unosi za 18. i 19. juli glase "1 × 0,05 Methylenblau". Narednih dana navedeno je pet i sedam doza iste količine, a do 22. jula u zapis je dodana i mala količina kinina. Linija temperature, koja u prvoj polovini grafikona oscilira između 37 °C i 39.5 °C, izravnava se nakon pojave boje i ostaje između približno 36 °C i 37.5 °C tokom preostale tri sedmice.

Pacijent je bio jedan od dvojice muškaraca, u radu opisanih kao kućni sluga i mornar. Spoj koji su primili već je petnaest godina bio komercijalna tekstilna boja, a njih dvojica spadaju među prve zabilježene osobe liječene potpuno sintetičkim lijekom usmjerenim na određeni organizam.

Boja je došla prva

Prvu komercijalno uspješnu sintetičku boju stvorio je William Henry Perkin 1856. Perkin je imao osamnaest godina, radio je u kućnoj laboratoriji tokom uskršnjih praznika i pokušavao sintetizirati kinin. Umjesto toga dobio je crni ostatak, rastvorio ga i otkrio boju koja se izvanredno vezivala za svilu. Patentirao ju je u augustu 1856., a do kraja 1857. imao je fabriku koja je snabdijevala jednu londonsku bojadisaonicu svile.

Adolf von Baeyer je 1875. sintetizirao crvenu boju i nazvao je eosin, prema Eos, grčkoj riječi za zoru. Heinrich Caro, tada direktor laboratorije u Badische Anilin- und Soda-Fabrik, razvio je 1876. zajedno s Baeyerom metilensko plavilo kao boju na bazi anilina za pamuk. Njegova hemijska struktura konačno je utvrđena tek oko devet godina kasnije.

To porijeklo i dalje je vidljivo u načinu na koji se supstanca naziva. "Metilensko plavilo" trgovački je naziv iz kataloga boja, a ne hemijski opis. Spoj na koji se naziv odnosi jeste metiltioninij-hlorid, a razlike između naziva, soli i njenih hidrata postaju važne čim neko počne vagati materijal ili čitati specifikaciju.

Bojenje je bilo most

Put od fabrike boja do bolnice vodio je kroz mikroskop, a počeo je prije nego što je metilensko plavilo uopće postojalo. Wilhelm Erb bio je prva osoba koja je primijenila sintetičku boju na krv, koristeći pikrinsku kiselinu 1865., i u nekim crvenim krvnim ćelijama uočio je mrežasti obrazac.

Doktorska disertacija Paula Ehrlicha iz 1878. uporedila je histološko bojenje s bojenjem tekstila i tvrdila da su oba procesa hemijske reakcije. Radeći pod Robertom Kochom na bacilu tuberkuloze, razvrstao je anilinske boje na kisele i bazne klase i utvrdio da svaka klasa boji različite dijelove ćelije. Godine 1880. pomiješao ih je: zasićenu otopinu metilenskog plavila ulijevao je u kiseli fuksin dok se supernatant nije izbistrio. Rezultat, koji je nazvao neutralen Farbkörper ili neutralna boja, davao je tri boje umjesto jedne, otkrio granule u polimorfonuklearnim ćelijama koje ranije nisu bile vidljive i omogućio prvi diferencijalni broj leukocita. Budući da su te granule primale obje komponente mješavine, Ehrlich je skovao riječ neutrofil za ćelije koje ih nose.

Dvije godine kasnije Koch je koristio metilensko plavilo za pronalaženje bacila tuberkuloze, a Ehrlich je 1883. poboljšao metodu. Godine 1886. objavio je drugačiju vrstu zapažanja: ubrizgao je boju živim životinjama, uporedio koliko je snažno svaki organ preuzima i zaključio da ona ima izražen afinitet prema mozgu i nervnom tkivu. Taj afinitet pripisao je oksidacijsko-redukcijskom ciklusu boje, koji je zapazio prethodne godine. Taj ciklus također objašnjava zašto otopina metilenskog plavila gubi boju kada se njen kisik potroši i ponovo je dobija kada se vrati zrak. Eksperimenti koji su prvi izmjerili posljedice tog ciklusa pripadaju kasnijoj deceniji, a sam mehanizam odvojena je tema od historije.

Parazit i ljubičasto jedro

Alphonse Laveran pronašao je parazita malarije 1880. pregledajući svježu, neobojenu krv. Za njegovo rutinsko uočavanje u osušenom razmazu bila je potrebna boja, a tadašnje metode bojenja davale su samo crvenu i plavu.

Poljski patolog Czesław Cheçinski je 1888. zamijenio kiseli fuksin eosinom i napravio mješavinu metilenskog plavila i eosina. Slučaj na kojem je zasnovao svoju metodu bio je vojnik koji je umro od malarije 30. septembra 1887. U krvnim razmazima Cheçinski je vidio plave oblike nalik tratinčici, danas prepoznate kao Plasmodium malariae, i srpaste oblike, danas prepoznate kao gametociti Plasmodium falciparum. Rezultat je istovremeno okončao dva konkurentska objašnjenja bolesti: teoriju mijazme i tvrdnju Edwina Klebsa i Corrada Tommasi-Crudelija da malariju uzrokuje bakterija.

Parazit je bio vidljiv. Njegovo jedro nije, zbog čega je njegova priroda ostala otvoreno pitanje. Ernst Malachowski, ljekar u Breslauu, riješio je taj problem prvo slučajno, a zatim namjerno. Godine 1889. primijetio je diferencijalno bojenje plazmodijskog jedra u jednom preparatu, ali ga nije mogao ponoviti. Zakiseljavanje metilenskog plavila nije pomoglo. Alkaliziranje boraksom svaki je put proizvelo isti učinak. Javno je demonstrirao tehniku 15. juna 1890. i objavio je iste godine, a potpuniji opis metode izašao je u augustu 1891.

Dmitri Romanowsky objavio je vlastitu verziju u septembru 1891. Njegove najbolje rezultate dala je zanemarena, pljesniva boca otopine metilenskog plavila stara više od dva mjeseca. Malachowskijev postupak bio je namjeran i, prema njegovim riječima, lako ponovljiv; Romanowskijev je bio slijepa ulica koja je uspjela jednom. Eponim je ipak pripao Romanowskom, a spor oko toga ko je proizveo ljubičastu boju koja je jedro učinila vidljivim zasebna je priča s vlastitim dokumentima.

**

Slika:** drugi grafikon temperature iz izvještaja Guttmanna i Ehrlicha iz 1891. Gornji panel obuhvata period od 13. do 24. jula, a donji od 25. jula do 5. augusta; unosi uz rub navode primijenjene doze, a temperatura ostaje blizu normalne tokom posljednje tri sedmice zapisa. Reproducirano iz izvještaja skeniranog za Kraftsa, Hempelmann i Skórska-Stania, Parasitology Research 111:1–6 (2012), PMID 22411634.

Pokazalo se da je sazrijevanje demetilacija

Niko od uključenih tokom 1890-ih nije znao šta "sazrijevanje" radi metilenskom plavilu. Odgovor je došao iz industrijske hemije. Heinrich August Bernthsen sintetizirao je 1883. matični spoj fenotiazin, 1885. utvrdio da metilensko plavilo pripada toj porodici i u istom periodu pokazao da alkalni uslovi uklanjaju metilne grupe iz boje, stvarajući spojeve koji se danas nazivaju azure bojama.

Bernard Nocht izdvojio je aktivnu frakciju 1898. i 1899. i mogao ju je nazvati samo Rot aus Methylenblau, crveno iz metilenskog plavila. Michaelis ju je 1901. identificirao kao azure I. Jenner je 1899. uveo apsolutni metanol kao otapalo za talog boje, čime je uklonjena potreba za toplotnim fiksiranjem krvnih razmaza; Leishman i Reuter spojili su oba unapređenja; Wright je 1902. objavio pojednostavljenu metodu. Giemsin doprinos, također iz 1902., bio je prestanak oslanjanja na nasumično sazrelu otopinu i korištenje izmjerenih količina poznatih boja. Zatim je odbio objaviti kako proizvodi čisti methylene azure i prodao metodu laboratoriji Dr. Grüblera, koja je proizvod prodavala kao azure I i tvrdila da je samo njena verzija autentična Giemsa boja.

Dva svjetska rata slučajno su dovršila posao. Kada njemačke boje više nisu bile dostupne, Lillie, Roe i Wilcox radili su na američkim zamjenama i otkrili da najbolje bojenje daju tri odvojene komponente: čisto metilensko plavilo, njegov produkt razgradnje azure B i eosin. Te tri komponente i danas ostaju glavni sastojci boje koja se koristi za dijagnostiku malarije, pod nazivom koji sada objedinjuje Malachowskog, Wrighta i Giemsu.

**

Slika:** prstenasti oblici Plasmodium falciparum u ljudskim crvenim krvnim ćelijama, obojeni metodom tipa Romanowsky. Ljubičasta struktura unutar prstena jeste hromatin koji je Malachowskijevo metilensko plavilo tretirano boraksom prvi put učinilo vidljivim. Slika: Ernst Hempelmann, objavljena kao javno vlasništvo.

Jedno ime, više materijala

Godine tokom kojih su te komponente razdvojene ostavile su problem koji je nadživio samu hemiju. Ralph Lillie je 1969. povukao granicu između bioloških boja, "proizvedenih prema strogim specifikacijama primjerenim njihovoj osjetljivoj i zahtjevnoj upotrebi", i nebioloških boja za bojenje tekstila, koje "zahtijevaju manje stroge i zahtjevne proizvodne standarde". Obje vrste proizvoda nosile su isto ime, a razlika među njima nikada nije bila samo pitanje stepena. Specifikacija napisana za pamuk i specifikacija napisana za dijagnostički reagens nisu međusobno zamjenjive, a materijal proizveden prema tekstilnoj specifikaciji nije bio namijenjen gutanju.

Azure B je najjasniji primjer. To je monodemetilirani oblik metilenskog plavila, ima vlastitu mjerljivu farmakološku aktivnost i bio je prisutan kao nekontrolirani sastojak kliničkih pripravaka metilenskog plavila više od jednog stoljeća prije nego što je iko razdvojio ta dva spoja. Jedna grupa utvrdila je da je ljudsko tkivo uzorkovano tokom obdukcije nakon primjene metilenskog plavila sadržavalo 5 do 14 per cent nepromijenjenog metilenskog plavila i 86 do 95 per cent azure B. Treba li određeni pripravak sadržavati azure B i u kojoj granici pitanje je specifikacije, a istraživanje o azure B kao nečistoći i metabolitu nastavlja odatle.

Specifikacija je također mjesto na kojem se nalazi praktična posljedica. Usklađenost sa USP standardom put je do najviše čistoće koju tržište nudi, jer je riječ o potpunom objavljenom standardu ispitivanja, a ne o jednom mjerenju. Obuhvata identitet, sadržaj, organske nečistoće uključujući azure boje, rezidualna otapala, elementarne nečistoće, ostatak nakon žarenja, mikrobiološke granice i bakterijske endotoksine. Certifikat koji navodi rezultat za teške metale i naziva ga usklađenošću sa USP standardom naveo je samo jednu stavku s tog spiska.

Blupreme nabavlja svoje metilensko plavilo od farmaceutskog proizvođača i objavljuje potpuni certifikat analize, uz ispitivanje cijele USP specifikacije, a ne samo teških metala. Vodič za čitanje certifikata analize i šta oznaka USP utvrđuje, a šta ne objašnjavaju kako provjeriti dokument u odnosu na navedenu tvrdnju.

Šta historija dopušta zaključiti, a šta ne

Porijeklo je stvarno i duže je nego što većina stranica proizvoda sugerira. Metilensko plavilo korišteno je za liječenje malarije 1891., 1899. je prijavljeno kao sedativ kod agitiranih psihoza, a njegov bočni lanac povezuje ga s kinakrinom, hlorokinom, prometazinom i hlorpromazinom. Ehrlichov rad iz 1890. s Arthurom Leppmannom opisao je ublažavanje neuralgičnog i reumatskog bola, a zatim razmotrio i odbacio mogućnost ispitivanja boje kod mentalnih bolesti.

Ništa od toga ne utvrđuje savremenu primjenu. Rezultat za malariju iz 1891. zasnivao se na dva pacijenta i grafikonu temperature. Dugogodišnja poznatost jedne molekule razlog je za njeno proučavanje, a ne rezultat. Historija spoja kao lijeka i savremena ispitivanja kod malarije odgovaraju na drugačija pitanja od onih koja je Ehrlich postavljao, a ishodi se moraju tumačiti prema vlastitim kriterijima.

U zapisu postoji jedan detalj koji pripada sadašnjosti, a ne prošlosti. Kada su istraživači tokom 2000-ih provodili ispitivanja metilenskog plavila kod malarije u Burkini Faso, našli su se u konkurenciji za materijal farmaceutskog kvaliteta i izvijestili da je cijena sirovine porasla približno stotinu puta nakon što je dobila GMP validaciju. Boja se mogla zamijeniti. Lijek nije mogao. Razlika koju je Lillie povukao 1969. ista je ona koja danas određuje šta se nalazi u boci.