Статия
Метиленово синьо и митохондрии: електронен транспорт и доказателства
Представете си два препарата един до друг. И двата съдържат мозъчни митохондрии, отровени с ротенон — химично вещество, което блокира комплекс I на дихателната верига. В единия експериментаторът добавя с пипета микромоларна доза метиленово синьо. Потреблението на кислород частично се възстановява. Мембранният потенциал частично се връща. Синтезът на ATP се възобновява в малка степен. В съседната кювета сензор за пероксид показва другата половина от картината: образуването на водороден пероксид се е увеличило няколкократно при всяка изпитана доза и при всеки изпробван субстрат.
И двете измервания са верни. Метиленовото синьо е преносител на електрони, който може да поддържа потока покрай увреден участък от дихателната верига, но същият този пренос има цена — образуване на пероксид. Ако държите едновременно сметка за двата факта, литературата за действието на метиленовото синьо върху митохондриите става разбираема. Ако вземете предвид само единия, тя изглежда като разказ за чудо или за опасност според това коя публикация сте отворили първо.
Преносът на електрони, обяснен просто
Дихателната верига е щафетна система. Електроните навлизат през комплекс I (от NADH) или през комплекс II и сродни флавинови ензими (от сукцинат и подобни донори), преминават през комплекс III към подвижния преносител цитохром c, а след това през комплекс IV към кислорода. При всяко предаване се изпомпват протони през вътрешната мембрана, а полученият градиент задвижва синтеза на ATP. Блокирайте която и да е станция и потокът преди нея спира.
Метиленовото синьо се включва като паралелен куриер. Окислената му форма приема електрони от преносители по-рано във веригата и се превръща в безцветната редуцирана форма — левкометиленово синьо. Тя след това предава електроните по-нататък във веригата и отново става синя. Двете форми са описани в обяснението на окислително-редукционната двойка, а по-общото поведение при този пренос е разгледано в обяснението на общия механизъм. Отвореният въпрос е къде куриерът се връща във веригата: в хинол-свързващия джоб на комплекс III, известен като Qo място, или директно при цитохром c. Кой изход преобладава зависи от условията, както подробно е изложено в анализа на заобикалянето на комплекс III.
Какво всъщност измерват три изследвания с гризачи
И трите изследвания използват изолирани мозъчни митохондрии, тоест органели, извадени от клетката и суспендирани в буфер с определен състав. Няма цели клетки, няма животни, на които е прилагано веществото, няма участници хора. Концентрациите се отнасят до средата около органелите, а не до перорална доза за човек. Ако запазите тази рамка, числата говорят ясно.
Първото изследване, проведено с изолирани мозъчни митохондрии от морски свинчета при концентрации от 100 наномола на литър до 2 микромола на литър, проследява ползата и цената в един и същ препарат. В здрави митохондрии багрилото повишава потреблението на кислород в покой, но не променя дишането, стимулирано от ADP, така че съпътстващото производство на ATP не се подобрява. При блокада на комплекс I концентрация от 2 микромола на литър възстановява синтеза на ATP от 46 до 93 наномола на минута на милиграм при нормална скорост около 1109. При блокада на комплекс III същата доза възстановява производството на ATP от около 46 до 63 при нормална скорост около 910. Мембранният потенциал и поемането на калций частично се възстановяват. Блокадата на комплекс IV с цианид не може да бъде заобиколена, което поставя полезния изход за електроните преди функциониращия комплекс IV. Всяко възстановяване е статистически значимо и малко: едноцифрени проценти от нормалното производство на ATP.
Второто изследване, проведено с митохондрии от мозъчната кора на мишки при около 1 микромол на литър, потвърждава заобикалянето на комплекс I и установява граница при комплекс III. Ротенонът намалява дишането от около 121 до под 2 наномола кислород на минута на милиграм, а багрилото го повишава до около 21 — приблизително една шеста от нормалното, докато мембранният потенциал се възстановява почти напълно. Но след блокада на комплекс III нито дишането, нито потенциалът се възстановяват при концентрации от 1 до 5 микромола на литър, а блокадата потиска пероксидния сигнал, предизвикан от багрилото. Авторите предполагат, че редуцираното багрило предава електроните си в Qo мястото на комплекс III: когато това място е заето, куриерът няма къде да ги достави.
Третото изследване, проведено с мозъчни митохондрии от мишки, плъхове и морски свинчета главно при 2 микромола на литър, проверява пряко противоречието и установява, че блокада на комплекс III може да бъде заобиколена. Когато инхибиторът на Qo мястото миксотиазол намалява базалното дишане с 88 процента, багрилото възстановява потреблението на кислород до около 62 процента от скоростта без блокада. При пряка проверка концентрация от половин микромол на литър редуцира екзогенен цитохром c дори при блокиран комплекс III, което подкрепя наличието на път от NADH през багрилото до цитохром c и нататък до комплекс IV. Но възстановеното дишане се държи необичайно: добавеният ADP намалява потреблението на кислород, вместо да го повишава, а блокирането на синтеза на ATP стимулира дишането. Мембранният потенциал се възстановява само частично. Високото потребление на кислород при обърнато сопрягане не е нормално производство на енергия.
Защо лабораториите не са единодушни и какво изяснява въпроса
Обяснението с различия между видовете отпада първо. Третата група повтаря работата при три вида гризачи и получава качествено еднакво заобикаляне при всички тях, включително при мишия щам, при който по-рано е съобщено, че то липсва. Различават се обаче концентрацията (1 спрямо 2 микромола на литър), дозите на инхибиторите, буферите, методите за изолиране и най-вече сравняваното енергетично състояние: заобикалянето е най-ясно преди добавянето на ADP, точно когато се появява парадоксалният отговор към ADP. Затова коректната схема показва два зависими от условията изхода — един при Qo мястото и един при цитохром c. Куриерът доставя там, където местните химични условия му позволяват.
Цената в пероксид
Данните за цената са също толкова последователни, колкото и данните за частичното възстановяване. В работата с морски свинчета багрилото повишава отделянето на пероксид при всяко изпитано условие — в покой, при синтез на ATP и при химично увреждане — и при трите субстрата. По време на синтез на ATP отделянето нараства от около 148 до над 1500 пикомола на минута на милиграм при 1 микромол на литър, а дори 100 наномола на литър увеличават сигнала повече от четирикратно. Багрилото също забавя отстраняването на пероксида приблизително 2.6 пъти, така че сигналът отразява по-бързо образуване плюс по-бавно отстраняване. Предложеният химичен механизъм е пряка редукция на кислорода от редуцираното багрило без откриваем супероксид, макар това да остава интерпретация, а не доказана стъпка.
Работата с мишки усложнява картината по полезен начин. Пероксидът нараства рязко с дозата — от изходно ниво около 76 до почти 2000 пикомола на минута на милиграм при 2 микромола на литър — но блокадата на комплекс III потиска компонента, предизвикан от багрилото. Ако пероксидът се образуваше само от реакцията на редуцираното багрило с кислорода, блокирането на веригата не би трябвало да има толкова голямо значение. То обаче има, следователно веригата участва. Прегледът на антиоксидантното и прооксидантното действие поставя тази двойственост в по-широк контекст, а анализът на кислорода спрямо ATP обяснява защо само данните за кислорода никога не са достатъчни, за да обосноват твърдение за енергията.
Частичното възстановяване не е поправка
Фразата, която трябва да изоставим, е „поправя ли метиленовото синьо митохондриите“. Поправката би означавала трайна корекция: възстановени комплекси, сопрягане, което се запазва след отстраняването на веществото, възстановяване в цели клетки, а след това подобрена функция в жив организъм. Нито една от трите публикации не показва това. Те показват краткосрочно пренасочване в прясно изолирани органели по време на изкуствена химична блокада, с производство на ATP, което е малка част от нормалното, и понякога с откровено необичайно сопрягане. Ротенонът и антимицинът са лабораторни инструменти, а не модели на стареенето или на митохондриални заболявания при човека. Нищо тук не означава повече енергия за здрав човек — това е отделен въпрос за доказателствата, със собствена литература за изследвания при хора.
Три ограничения поддържат коректността на всеки извод за биохакинг. Първо, концентрацията в средата не е доза: 0.1 до 2 микромола на литър около изолирани органели не казват нищо за това какво перорално количество би създало такава свободна концентрация при митохондрия в човешкия мозък, особено след като багрилото се натрупва или освобождава в зависимост от самия мембранен потенциал. Второ, кислородът не е енергия: багрилото може да повишава потреблението на кислород чрез циклични реакции и изтичане на електрони, както и чрез продуктивно фосфорилиране, затова респирометрията без измервания на ATP и мембранния потенциал не обосновава твърдение за енергията. Трето, ползата и натоварването трябва да присъстват в едно изречение: всяко твърдение за възстановен потенциал или ATP, което пропуска съпътстващото нарастване на пероксида, представя експеримента некоректно. Допълнителни уточнения са разгледани в окислително-редукционния баланс на NAD, формата на зависимостта доза–отговор и ръководството за избор на методи за изследване.
Една практическа бележка: преносът на електрони е свойство на точно определената молекула. Деметилирани сродни съединения като Azure B също са окислително-редукционно активни, но имат различно поведение, така че частично разграден разтвор означава различен експеримент от този с неразградено багрило. Това е една от причините да се настоява за пълната фармакопейна спецификация и публикуван документ за партидата, а не само за проверка за метали. Химичните реакции, задвижвани от светлина, добавят подобно уточнение за употребите с осветяване, разгледано в комбинациите с червена светлина.
Ограниченото твърдение остава валидно въпреки всичко това и си струва да го запазим: метиленовото синьо може при определени условия да действа като куриер на електрони в увредени изолирани митохондрии, като частично запазва потока с цената на образуване на пероксид. Всичко отвъд това — енергия, дълголетие, поправка — очаква доказателства, които тези изследвания никога не са били предназначени да предоставят.