亚甲基蓝的历史：从染料到医药与研究

亚甲基蓝先进入了患者体内，之后才进入药房。

保罗·古特曼和保罗·埃尔利希在1891年发表的关于这种染料用于疟疾的报告中，包含两张体温图。第二张记录了13 July至5 August的情况，治疗内容逐日写在图表边缘。18和19 July的条目写着“1 × 0,05 Methylenblau”。随后几天记录的是相同剂量的五次和七次给药，到22 July时，记录中又加入了少量奎宁。在图表前半段，体温曲线在37 °C和39.5 °C之间波动；染料开始使用后，曲线趋于平坦，并在余下三周内维持在约36 °C至37.5 °C之间。

两名患者中的一人是家庭佣工，另一人是水手，论文中如此描述他们。他们接受的这种化合物此前已作为商业纺织染料使用了十五年，而这两人也是最早有记录接受针对特定生物体的全合成药物治疗的人之一。

染料最先出现

第一种获得商业成功的合成染料由威廉·亨利·珀金于1856年制成。当时珀金十八岁，在复活节假期期间于家中的实验室工作，试图合成奎宁。他得到的却是一种黑色残渣；将其溶解后，他发现了一种能鲜艳而牢固地染在丝绸上的颜色。他于August 1856为其申请专利，到1857年底，他的工厂已经开始向伦敦一家丝绸染坊供货。

1875年，阿道夫·冯·拜耳合成了一种红色染料，并以希腊语中表示黎明的Eos为其命名为eosin。1876年，时任Badische Anilin- und Soda-Fabrik实验室主任的海因里希·卡罗与拜耳共同开发了亚甲基蓝，将其作为一种用于棉织物的苯胺类染料。直到大约九年后，它的化学结构才最终确定。

这种起源至今仍体现在该物质的命名方式中。“Methylene blue”是染料目录中的商品名，而不是化学描述。它所指的化合物是methylthioninium chloride；一旦需要称量材料或阅读规格，名称、盐及其水合物之间的区别就会变得重要。

染色成为桥梁

从染料厂通往医院的道路经过了显微镜，而这条道路在亚甲基蓝出现之前就已经开始。威廉·埃尔布是第一个将合成染料应用于血液的人，他在1865年使用苦味酸，并在部分红细胞内部观察到网状图案。

保罗·埃尔利希1878年的博士论文将组织学染色与纺织品染色进行比较，并主张两者本质上都是化学反应。在罗伯特·科赫手下研究结核杆菌期间，他将苯胺染料分为酸性和碱性两类，并确立了不同类别会染色细胞的不同部分。1880年，他把两者混合起来：将饱和亚甲基蓝溶液倒入酸性品红中，直到上清液变清。所得染料被他称为 neutralen Farbkörper，即中性色素，它产生的不是一种颜色，而是三种颜色；它显示出此前不可见的多形核细胞颗粒，并使首次白细胞分类计数成为可能。由于这些颗粒会同时吸收混合物中的两种成分，埃尔利希将携带这些颗粒的细胞命名为中性粒细胞。

两年后，科赫使用亚甲基蓝发现结核杆菌；1883年，埃尔利希又改进了这一方法。1886年，他发表了另一类观察结果：他将染料注射到活体动物中，比较各器官吸收染料的程度，并得出结论，认为这种染料对脑和神经组织具有显著亲和力。他将这种亲和力归因于染料的氧化还原循环，而这一现象是他在前一年观察到的。这种循环也解释了为什么亚甲基蓝溶液在氧气耗尽时会褪色，而空气重新进入后又会恢复颜色。首次测量这种循环所产生后果的实验属于更晚的年代，而其机制本身也是一个独立于历史的话题。

寄生虫与紫色细胞核

阿方斯·拉韦朗于1880年通过检查新鲜、未染色的血液发现了疟原虫。但若要在干燥血涂片中常规观察它，就必须使用染色剂，而当时的染色只能产生红色和蓝色。

1888年，波兰病理学家切斯瓦夫·切钦斯基用eosin取代酸性品红，制成了亚甲基蓝与eosin的混合染色剂。他的方法源于一名于30 September 1887死于疟疾的士兵。切钦斯基在血涂片中看到蓝色、雏菊状的形态，如今被认定为 Plasmodium malariae；他还观察到镰刀状形态，如今被认定为 Plasmodium falciparum 的配子体。这一结果同时终结了关于该疾病的两种竞争性解释：瘴气理论，以及埃德温·克莱布斯和科拉多·托马西-克鲁德利提出的疟疾由细菌引起的主张。

寄生虫已经可见，但它的细胞核仍不可见，因此其本质仍未确定。布雷斯劳的医生恩斯特·马拉霍夫斯基先是偶然发现，随后有意解决了这个问题。1889年，他注意到一种制剂中疟原虫细胞核出现了差异染色，但无法重现这一现象。酸化亚甲基蓝没有作用；用硼砂使其碱化后，则每次都能产生这种效果。他于15 June 1890公开演示了这项技术，并于同年发表，随后在August 1891公布了更完整的方法。

德米特里·罗曼诺夫斯基于September 1891发表了自己的版本。他得到最佳结果时使用的是一瓶被搁置、已经发霉且存放超过两个月的亚甲基蓝溶液。马拉霍夫斯基的方法是有意设计的，并且用他自己的话说，很容易重现；罗曼诺夫斯基的方法则只成功过一次，此后成为死路。尽管如此，这一冠名最终还是归给了罗曼诺夫斯基，而究竟是谁制出了使细胞核显现的紫色染色效果这一争议则是另一个有其独立文献记录的故事。

图： 古特曼和埃尔利希1891年报告中的第二张体温图。上半部分记录13至24 July，下半部分记录25 July至5 August；边缘条目标明给予的剂量，而记录最后三周的体温均维持在接近正常水平。图片转载自该报告的扫描版本，见Krafts、Hempelmann和Skórska-Stania，Parasitology Research 111:1–6 (2012)，PMID 22411634。

所谓“熟化”原来是去甲基化

1890年代的参与者都不知道所谓“熟化”究竟对亚甲基蓝做了什么。答案最终来自工业化学。海因里希·奥古斯特·贝恩特森于1883年合成了母体化合物phenothiazine，1885年确认亚甲基蓝属于这一化合物家族，并在同一时期证明碱性条件会从染料中去除甲基，生成如今称为azures的化合物。

伯纳德·诺赫特于1898和1899年提取出活性组分，但只能将其称为 Rot aus Methylenblau，即“来自亚甲基蓝的红色物质”。Michaelis于1901年确认其为azure I。Jenner于1899年引入无水甲醇作为染料沉淀物的溶剂，从而不再需要对血涂片进行加热固定；Leishman和Reuter将这两项改进结合起来；Wright于1902年发表了一种简化方法。同样是在1902年，Giemsa的贡献是不再依赖随机熟化的溶液，而是改用已知染料的定量配比。之后，他拒绝公开纯methylene azure的制备方法，并将该方法出售给Dr. Grübler's laboratory；后者以azure I的名称销售该产品，并宣称只有自己的版本才是真正的Giemsa染色剂。

两次世界大战意外地完成了余下的工作。当德国染料无法获得时，Lillie、Roe和Wilcox开始研究美国替代品，并发现最佳染色效果来自三个分离的成分：纯亚甲基蓝、其分解产物azure B以及eosin。这三种成分至今仍是用于诊断疟疾的染色剂中的主要成分，而这种染色方法如今以Malachowski、Wright和Giemsa三人的名字共同相连。

图： 人红细胞中的 Plasmodium falciparum 环状体，采用Romanowsky型方法染色。环内的紫色结构是染色质，Malachowski经硼砂处理的亚甲基蓝首次使其变得可见。图片由Ernst Hempelmann提供，并发布至公有领域。

一个名称，多种材料

这些成分经过多年才被逐一分离，而由此留下的问题比相关化学研究本身延续得更久。Ralph Lillie在1969年明确区分了生物染色剂和非生物染色剂：前者“按照与其精细且要求严格的用途相匹配的严格规格制造”，而用于纺织着色的后者则“所需制造标准没有那么严格和苛刻”。两类产品使用相同的名称，而二者之间的差异从来不仅仅是程度上的差异。针对棉织物制定的规格与针对诊断试剂制定的规格不可互换，按纺织用途规格制造的材料也并非用于吞服。

azure B是最清楚的例子。它是亚甲基蓝的单去甲基化形式，本身具有可测量的药理活性，并且在一个多世纪中一直作为未受控制的成分存在于临床亚甲基蓝制剂中，直到后来才有人将两者分离。有一个研究团队发现，在给予亚甲基蓝后进行尸检所采集的人体组织中，含有5至14 per cent未变化的亚甲基蓝，以及86至95 per cent的azure B。某种制剂是否应含有azure B，以及允许的限度是多少，属于规格问题；关于azure B作为杂质和代谢物的研究则从这里继续展开。

规格也是实际影响所在。符合USP标准是获得市场上最高纯度的途径，因为USP是一套完整公开的检测标准，而不是单项测量。它涵盖鉴别、含量测定、有机杂质（包括azure染料）、残留溶剂、元素杂质、炽灼残渣、微生物限度以及细菌内毒素。仅报告一项重金属检测结果并将其称为符合USP标准的证书，只报告了这份清单中的一项。

Blupreme从一家制药企业采购其亚甲基蓝，并公布完整的分析证书，检测整个USP规格，而不仅仅是重金属。分析证书阅读指南以及USP标识能够和不能证明什么说明了如何根据文件核实相应声明。

历史能够证明什么，又不能证明什么

这条历史脉络确实存在，而且比大多数产品页面暗示的更长。亚甲基蓝于1891年用于治疗疟疾；1899年有报告称其在激越性精神病中被用作镇静剂；其化学侧链的发展还贯穿了quinacrine、chloroquine、promethazine和chlorpromazine。埃尔利希与Arthur Leppmann在1890年的论文中描述了神经痛和风湿性疼痛得到缓解的情况，随后考虑过、但最终没有测试这种染料在精神疾病中的应用。

这些历史记录都不能确立一种现代用途。1891年的疟疾结果只有两名患者和一张体温图。对一种分子长期熟悉，是研究它的理由，而不是研究结果。该化合物作为药物的历史以及现代疟疾试验所回答的问题，与埃尔利希当年提出的问题不同，各自的终点必须按其自身条件来解读。

记录中还有一个细节属于现在，而不只是过去。2000年代，研究人员在布基纳法索开展亚甲基蓝疟疾试验时，发现自己需要竞争获取药用级材料，并报告称，一旦原料获得GMP验证，其价格上升了约一百倍。染料可以被替代。药物不可以。Lillie在1969年划出的界线，与今天决定一个瓶子里究竟装有什么的界线，是同一条界线。 :::