Xanh methylen đi vào tế bào như thế nào: khử, tái oxy hóa và phân bố vào màng

Khi quan sát một đĩa tế bào nội mô thu nhận xanh methylen, cách diễn giải có vẻ hiển nhiên cũng chính là cách diễn giải sai. Môi trường mất màu xanh, còn tế bào xuất hiện các hạt màu xanh, vậy hẳn chất nhuộm đã đi qua màng dưới dạng phân tử màu xanh. Các thí nghiệm lại cho thấy điều khác. Dạng màu xanh hầu như không đi qua màng. Dạng đi qua là dạng không màu, còn màu xanh bạn nhìn thấy bên trong được tạo ra ngay trong tế bào, sau khi chất nhuộm đã vào đó.

Sự đảo ngược này quan trọng vì nó quyết định những gì màu nhuộm có thể và không thể cho biết. Các hạt màu xanh phản ánh chất nhuộm ở dạng oxy hóa, đã được tái oxy hóa và giữ lại trong các bào quan. Chúng không phản ánh tổng lượng chất nhuộm trong tế bào, không phản ánh lượng chất nhuộm ở dạng khử và không đo lường tác động sinh học. Để hiểu vì sao, hãy theo dõi ba bước: khử tại bề mặt, khuếch tán của dạng khử, rồi tái oxy hóa và giữ lại bên trong.

Hai dạng hoạt động như hai phân tử khác nhau

Xanh methylen ở dạng oxy hóa là một hệ vòng phẳng mang điện tích dương. Nó tan trong nước, hấp thụ ánh sáng mạnh ở khoảng 600 đến 700 nanometers và có màu xanh. Điện tích là điểm mấu chốt. Một phân tử mang điện tích, ưa nước không dễ dàng xuyên qua màng lipid, nên cách diễn đạt thận trọng trong tài liệu khoa học là tương đối khó thấm qua màng, chứ không phải hoàn toàn không thấm qua màng.

Xanh methylen ở dạng khử, gọi là leucomethylene blue, không màu, không mang điện tích và tan trong chất béo. Khi điện tích bị loại bỏ, màng không còn là bức tường ngăn cách. Phân tử dạng khử dễ dàng khuếch tán qua màng; khi đã vào một khoang có tính oxy hóa cao hơn, nó có thể lại mất electron và trở về dạng màu xanh, mang điện tích, bị giữ lại. Vì vậy, hóa học oxy hóa–khử của chất nhuộm cũng chính là cơ chế vận chuyển của nó. Thay đổi số electron đồng nghĩa với thay đổi khả năng thấm qua màng.

Electron cho bước đầu tiên đến từ chính tế bào. Tế bào động vật có vú thực hiện vận chuyển electron qua màng sinh chất, chuyển các đương lượng khử từ chất cho bên trong tế bào ra chất nhận tại bề mặt. Hoạt động xuyên màng sinh chất này là chức năng bình thường của tế bào, có ở hầu hết các loại tế bào. Enzyme reductase ở bề mặt tế bào nội mô xử lý các chất nhuộm thiazine có một đặc điểm đáng chú ý giống các enzyme khác: nó vẫn hoạt động khi có cyanide và azide ở những liều làm ngừng các bước phía sau. Sự tách biệt đó là điểm then chốt của toàn bộ câu chuyện.

Sự phân bố giữa các pha được nghiên cứu trước và gần như đã giải thích được sự thu nhận

Năm 1929, Marian Irwin tại Viện Rockefeller đặt ra một câu hỏi đơn giản hơn. Có lẽ chất nhuộm đi vào tế bào chỉ nhờ sự phân bố giữa nước và các lớp chất béo của tế bào, và một lớp chloroform có thể thay thế những lớp chất béo ấy trong thí nghiệm. Trong các nghiên cứu về sự thâm nhập bằng phương pháp quang phổ (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/19872469/), bà lắc các dung dịch chất nhuộm trong nước với chloroform, rồi so sánh lượng đi vào pha hữu cơ với lượng đi vào các tế bào tảo sống.

Hai phát hiện từ công trình đó vẫn đáng chú ý. Thứ nhất, dung dịch xanh methylen thương mại chứa trimethyl thionine, nay gọi là azure B, và tạp chất này thâm nhập nhanh hơn chính xanh methylen, đặc biệt ở pH kiềm, khi dạng base tự do tan trong lipid chiếm ưu thế. Một phần sự đi vào tế bào tưởng như của xanh methylen thực ra là sự đi vào có chọn lọc của azure B. Thứ hai, pH quyết định kết quả bằng cách quyết định trạng thái ion hóa, và tế bào bị tổn thương cho phép lượng chất nhuộm đi vào lớn hơn nhiều so với tế bào nguyên vẹn. Hệ số phân bố và trạng thái điện tích chi phối lượng được hấp thu trong cả hệ nhân tạo lẫn tế bào sống; sự tương đồng giữa hai hệ ủng hộ ý tưởng rằng ranh giới tế bào có các lớp không phải pha nước.

Mô hình này có tính tiên phong trong cách nhìn về lipid và sự ion hóa, nhưng không thể phân biệt một chất nhuộm phân bố giữa các pha mà vẫn giữ nguyên dạng với một chất nhuộm được biến đổi hóa học tại bề mặt, đi qua dưới một dạng khác rồi được chuyển trở lại bên trong. Để phân biệt điều đó cần một thí nghiệm khác, và thí nghiệm ấy xuất hiện bảy mươi năm sau ở tế bào nội mô phổi.

Khử bên ngoài, giữ lại bên trong

Merker và các cộng sự nghiên cứu tế bào nội mô động mạch phổi bò được nuôi cấy và đề xuất một chuỗi ba bước: chất nhuộm dạng oxy hóa được khử trên bề mặt tế bào thành dạng không màu, ưa lipid; dạng khử khuếch tán vào trong; rồi quá trình tái oxy hóa nội bào tái tạo dạng oxy hóa khó thấm qua màng, khiến dạng này tích lũy. Sau đó, nghiên cứu về sự thu nhận thiazine ở tế bào nội mô của họ kiểm tra chuỗi này bằng cách tìm cách làm gián đoạn nó tại những vị trí cụ thể.

Công cụ đầu tiên là ferricyanide, một chất nhận electron không thể đi vào tế bào. Khi enzyme ở bề mặt khử chất nhuộm màu xanh thành dạng không màu bên ngoài tế bào, ferricyanide có thể lấy lại các electron đó, tái tạo chất nhuộm màu xanh trong môi trường trước khi nó kịp đi qua màng. Khi ferricyanide vẫn hiện diện ở lượng dư (10 micromolar chất nhuộm so với 50 đến 500 micromolar ferricyanide), sự thu nhận chất nhuộm gần như dừng lại; chỉ sau khi ferricyanide đã được tiêu thụ hết, sự thu nhận mới tiếp tục với tốc độ bình thường. Động học cũng cho thấy cùng một điều theo cách khác. Ferricyanide biến mất với tốc độ gần như không đổi, phù hợp với một dòng khử ổn định tại bề mặt cung cấp electron cho một chất trung gian có thể tái sử dụng, trong khi chất nhuộm ngoại bào giảm theo hàm mũ khi lượng chất nhuộm còn lại cạn dần. Một dòng ổn định kết hợp với một lượng dự trữ đang cạn dần có nghĩa là tín hiệu ferricyanide phản ánh quá trình khử liên tục, chứ không phải các phân tử chất nhuộm rời khỏi dung dịch.

Công cụ thứ hai loại bỏ hoàn toàn bước đi qua màng. Nhóm nghiên cứu gắn toluidine blue O, một chất nhuộm thiazine có quan hệ gần, vào một chuỗi polyacrylamide lớn đến mức không thể đi vào tế bào ở cả hai trạng thái oxy hóa. Tế bào vẫn khử được chất nhuộm đã gắn vào chuỗi này. Như vậy, quá trình khử không cần chất nhuộm tiếp cận bên trong tế bào. Bộ máy thực hiện quá trình này nằm lộ ra ở bề mặt hoặc được ghép nối điện với bề mặt.

Tiếp đó là sự tách biệt làm nên tiêu đề của bài báo. Cyanide và azide ở 2 millimolar ức chế mạnh sự tích lũy chất nhuộm; dưới kính hiển vi, các thể vùi màu xanh đậm và tím thường bao quanh nhân gần như biến mất. Tuy nhiên, không chất ức chế nào làm chậm quá trình khử ngoại bào: chu trình ferricyanide tiếp tục không suy giảm, và chất nhuộm gắn với polymer không thấm qua màng vẫn được khử. Điểm bị chặn nằm ở các bước phía sau. Cyanide và azide ngăn quá trình tái oxy hóa và giữ lại trong tế bào, chứ không ngăn quá trình khử tại bề mặt. Các đối chứng về khả năng sống của tế bào củng cố cách diễn giải này, vì tế bào vẫn giữ được enzyme chỉ dấu trong bào tương là lactate dehydrogenase qua các xử lý đó; do vậy, việc mất khả năng thu nhận không đơn thuần là do nhiễm độc hay vỡ màng.

Một lưu ý trong bài báo vẫn còn giá trị. Các thể vùi màu xanh nằm quanh nhân nhưng không nằm trong nhân, phù hợp với quá trình oxy hóa bên trong các bào quan dưới tế bào, song nghiên cứu không xác định đó là những bào quan nào. Những kiểu phân bố tương tự ở các loại tế bào khác từng được cho là thuộc lysosome dựa trên bằng chứng ít ỏi. Có thể xem việc giữ lại chất nhuộm là đã được xác lập, còn vị trí cụ thể vẫn chỉ là nhận định tạm thời. Độc giả muốn theo dõi electron sẽ đi đâu tiếp theo có thể đọc thêm về vận chuyển electron và xử lý oxy hóa–khử ở ty thể và bức tranh rộng hơn về hấp thu và phân bố theo đường đưa vào.

Màu nhuộm không phải là mức phơi nhiễm

Một nghiên cứu thứ ba cho thấy điều gì xảy ra khi cơ chế thu nhận này được đối chiếu với một chỉ số sinh học. Scott và các cộng sự phát hiện methyl beta cyclodextrin, một phân tử đường dạng vòng xuyến, liên kết trực tiếp với xanh methylen, với hằng số liên kết khoảng 310 trên molar đối với phức bao, so với khoảng 5846 trên molar đối với quá trình tạo dimer của chất nhuộm. Ở nguyên bào sợi L929, sự liên kết này ngăn cả sự nhuộm màu tế bào lẫn sự kích thích thu nhận glucose: ủ trước với cyclodextrin ngăn sự nhuộm xanh, còn thêm nó sau đó làm màu nhuộm mất nhanh hơn. Khi tín hiệu quang học màu xanh rời khỏi tế bào, sự hoạt hóa vận chuyển glucose cũng giảm theo sát.

Các tác giả diễn giải mối tương quan này là bằng chứng nghiêng về tương tác trực tiếp giữa chất nhuộm và một protein trong con đường hoạt hóa chất vận chuyển glucose, hơn là một cơ chế stress oxy hóa kéo dài. Suy luận đó hợp lý nhưng có giới hạn. Thí nghiệm không xác định protein ấy là gì, không cho thấy sự liên kết với chính chất vận chuyển, và mối tương quan giữa mất màu nhuộm với mất tác động không thể loại trừ mọi con đường qua trung gian oxy hóa–khử.

Bài học bền vững nằm ở cách đo lường. Màu nhuộm quan sát bằng quang học phản ánh chất nhuộm nhìn thấy được, ở dạng oxy hóa và gắn với tế bào. Nó hoàn toàn bỏ sót lượng chất nhuộm không màu ở dạng khử, nên một tế bào nhạt màu vẫn có thể chứa các đương lượng chất nhuộm; còn một tế bào nhuộm đậm phản ánh chất nhuộm dạng oxy hóa bị giữ lại, chứ không phải tổng mức phơi nhiễm của mô hay độ lớn của tác động. Lưu ý tương tự cũng áp dụng ở quy mô lớn hơn: so sánh màu nhuộm giữa các loại tế bào, hoặc xem một lát cắt mô đậm màu là bằng chứng của mức phơi nhiễm cao hơn, đều lặp lại sai lầm ban đầu khi quan sát đĩa tế bào. Sự thu nhận là một chu trình khử, khuếch tán và tái oxy hóa; bất kỳ ảnh chụp tức thời nào của dạng màu xanh cũng chỉ cho thấy một góc của chu trình đó. Những hệ quả thực tiễn đối với nhuộm và thao tác trong phòng thí nghiệm cũng như việc diễn giải các nhận định về liều và mức phơi nhiễm được rút ra trực tiếp từ điều này.