Як працює метиленовий синій? Окисно-відновна хімія та механізми

Закрита пробкою колба на лабораторному столі — найкоротший чесний вступ до того, як працює метиленовий синій. Вода, глюкоза, щіпка гідроксиду натрію та достатньо барвника, щоб рідина стала глибокого, безпомилково впізнаваного синього кольору. Зачекайте кілька хвилин — і синій колір зникає, доки колба не починає виглядати як колба з водою. Струсніть її — і колір миттєво повернеться. Потім він знову зникає, і це повторюватиметься доти, доки є глюкоза, готова віддавати електрони, та кисень, готовий їх приймати.

У барвнику не змінилося нічого, крім кількості електронів, які він переносить. В окисненій формі він синій. У відновленій — ні. Майже все інше в терапевтичній та дослідницькій літературі про цю молекулу випливає з цього одного оборотного кроку, адже молекула, здатна забрати електрони в одного партнера й передати іншому, є переносником, а переносник сам по собі нічого не робить. Те, що він робить, повністю залежить від того, що знаходиться на кожному його кінці.

Дві форми й чому ця пара має значення

Окиснена форма — це плоска позитивно заряджена кільцева система. Саме через цю плоску заряджену форму вона укладається поруч із нуклеїновими кислотами, зв’язується із сіалільованими структурами на клітинних мембранах і сильно поглинає видиме світло приблизно між 600 і 700 нанометрами — у тій частині спектра, яку людське око сприймає як синю.

Відновлена форма має інші властивості. Вона не несе заряду, розчиняється в жирах, а не у воді, і є безбарвною. Її іонізація за рівня pH усередині організму дуже низька — порядку кількох відсотків. Тому відновлена молекула легко перетинає клітинну мембрану шляхом дифузії, а потрапивши всередину, де середовище більш окиснювальне, може знову окиснитися й фактично залишитися там. Окиснена кільцева система плоска; відновлена може скручуватися. Ці структурні наслідки, як і сама зміна кольору, є окремою частиною історії двох форм і докладніше розглянуті в порівнянні метиленового синього та лейкометиленового синього.

Приймання електронів

Окиснений барвник може приймати електрони від широкого спектра донорів. Глюкоза в демонстраційній колбі — один із них. Усередині клітини іншими донорами є відновлені піридинові нуклеотиди та компоненти мітохондріального ланцюга перенесення електронів. Коли метиленовий синій відновлюється в тканині, що містить кисень, утворений ним цикл споживає і відновник, і кисень та продукує активні форми кисню, переважно пероксид водню. Барвник виходить із циклу незміненим і готовим пройти його знову.

Останній момент пояснює суперечність, яка інакше виглядає як недбалість. У літературі метиленовий синій описують і як прооксидант, і як антиоксидант, і обидва описи можуть бути обґрунтованими. Він може пригнічувати утворення супероксиду, діючи як штучний акцептор електронів і відводячи потік електронів від ферментних центрів, де інакше кисень перетворювався б на супероксидні радикали. У культурах клітин печінки було показано, що він індукує ферменти антиоксидантного захисту фази 2, зокрема тіоредоксинредуктазу 1 та NADPH-хіноноксидоредуктазу. Яку з цих двох сторін ви побачите, залежить від того, на якому кінці перенесення в цей момент бракує електронів. Питання на кшталт «чи є метиленовий синій антиоксидантом» сформульоване некоректно, доки не вказано, у якій системі, за якої концентрації та за наявності яких інших компонентів.

Передавання електронів далі

Щойно барвник отримує зайвий електрон, далі можуть відбутися три цілком різні процеси, які зазвичай описують під одним заголовком. Так робити не варто.

Він може передати електрон металевому центру. Найчіткіший приклад — гемоглобін, у якому залізо окиснилося з двовалентного до тривалентного стану. У такому стані він не може переносити кисень. В еритроцитах фермент відновлює барвник, а відновлений барвник потім неферментативно передає електрони окисненому залізу гему, відновлюючи функціональний гемоглобін і повертаючи барвник до його окисненої форми. Барвник при цьому не витрачається; він циклічно використовується знову. Клінічна ситуація, що ґрунтується на цій реакції, належить до лікарняної практики, а пояснення застосування метиленового синього при метгемоглобінемії описує, як його використовують і чому це відбувається під таким ретельним наглядом.

Важливе зауваження щодо джерел: два огляди, на яких ґрунтується ця стаття, називають різні відновлювальні кофактори для ферментативного етапу — в одному зазначено NADH, в іншому NADPH. Ця розбіжність справді існує й не вирішена в доступних тут джерелах, тому безпечніше описувати роль кожного компонента, а не називати один конкретний кофактор.

Він може передати кисню енергію або електрон, якщо є світло. Цей шлях існує лише за освітлення. Збуджений барвник переходить у триплетний стан, після чого можливі два механізми. За першого збуджений барвник безпосередньо взаємодіє із сусідньою молекулою, відбираючи водень або передаючи електрон, унаслідок чого утворюються радикали; взаємодія з водою таким шляхом утворює гідроксильні радикали. За другого енергія збудження передається безпосередньо кисню, утворюючи синглетний кисень — високоелектрофільну частинку, що розпадається протягом мікросекунд і загалом вважається основним шляхом, через який освітлений метиленовий синій пошкоджує мікробні клітини. Серед задокументованих наслідків — реакції з ліпідами й пептидами клітинної оболонки, а також із гуаніновими основами ДНК.

Практичний наслідок цього шляху полягає в тому, що освітлення змінює числові показники на порядки величини. У даних, зібраних Wainwright і Crossley, метиленовий синій проти Pseudomonas aeruginosa має мінімальну бактерицидну концентрацію близько 500 мікромолярів у темряві та близько 25 мікромолярів за світлової дози 12 джоулів на квадратний сантиметр. Для одного штаму Staphylococcus aureus значення в темряві та при освітленні становлять 5 мікромолярів в обох випадках. Іншими словами, те, чи можна взагалі вважати молекулу антимікробною, не є властивістю лише самої молекули; це властивість молекули разом зі світлом.

Він може діяти безпосередньо на ферментному центрі, без перенесення. Метиленовий синій окиснює двовалентне залізо, зв’язане із синтазою оксиду азоту, що вимикає фермент. Він блокує розчинну гуанілатциклазу, а концентрація від 1 до 10 мікромолярів регулярно використовується для цього в лабораторних умовах. Він пригнічує моноаміноксидазу типу A з IC50 від 27 до 180 наномолярів — саме цей механізм лежить в основі добре задокументованої взаємодії з інгібіторами зворотного захоплення серотоніну та є причиною, чому лікарські взаємодії метиленового синього становлять окрему категорію.

Ці три шляхи хімічно різні. Зведення їх до одного твердження, що метиленовий синій працює завдяки окисно-відновному циклу, — головна причина того, чому так багато текстів про нього одночасно звучать упевнено й залишаються розмитими.

Чотири відмінності, що визначають, чи має твердження про механізм узагалі якийсь зміст

Яка форма. Відновлений барвник не є взаємозамінним з окисненим. Інгібування ацетилхолінестерази добре ілюструє цю пастку: під час тривалої інкубації in vitro метиленовий синій поступово відновлюється до своєї безбарвної форми, і інгібування слабшає, оскільки відновлена молекула не пригнічує цей фермент. Аналіз, що триває достатньо довго, щоб змінити форму молекули, покаже слабший ефект і підштовхне до неправильного пояснення.

Яка концентрація. Лабораторний діапазон для інгібування розчинної гуанілатциклази становить від 1 до 10 мікромолярів. Для повного усунення глутамат-опосередкованої передачі в зрізах гіпокампа щурів знадобилося від 5 до 50 мікромолярів. Токсичні ефекти в культурі клітин описують за концентрацій понад 100 мікромолярів. Це не один і той самий експеримент, і механізм, підтверджений за 50 мікромолярів, не обов’язково діятиме в пацієнта, у якого концентрація в плазмі становить лише частку цього значення.

Який шлях введення. Абсолютна пероральна біодоступність становить близько 72 відсотків, а кінцевий період напіввиведення з плазми — від 5 до 7 годин. Пероральне введення створює вищі концентрації в кишечнику та печінці; внутрішньовенне — вищі концентрації в мозку. Шлях введення визначає, яка тканина зустрінеться з електронами.

Яка модель і чи було ввімкнене світло. Значна частина літератури про механізми базується на культурах клітин і дослідженнях на гризунах, а результати in vitro для цієї молекули залежать від впливу світла, мембранного потенціалу та окисно-відновного стану клітин, оскільки навіть лампи мікроскопа достатньо для її фотосенсибілізації. Від 65 до 85 відсотків введеної дози відновлюється до безбарвної форми в еритроцитах і периферичних тканинах. Кожна з цих змінних стоїть між чітким механізмом у лабораторному посуді та твердженням про людину.

Чому питання чистоти є питанням хімії

Освітлення деметилює метиленовий синій. Першим продуктом є Azure B, далі Azure A, потім тіонін, а вища інтенсивність світла спричиняє більше розкладання, ніж нижча. Отже, молекула, корисність якої полягає у здатності приймати й віддавати електрони, є молекулою, чиї ймовірні продукти деградації — близькі хімічні родичі, що залишаються в тому самому розчині. Склад вмісту контейнера — не косметична деталь.

Саме тому відповідність специфікації USP є змістовним критерієм для покупця. Продукт, який їй не відповідає, є барвником, а барвник містить домішки, зокрема Azure B, важкі метали та залишкові розчинники, яких людина, що його ковтає, не хоче отримувати. Додаткова пастка — продавець, який перевіряє лише важкі метали й подає результат як повну відповідність вимогам. Blupreme співпрацює з фармацевтичним виробником метиленового синього та перевіряє повний набір характеристик: ідентичність, чистоту, органічні домішки, залишкові розчинники, елементні домішки, залишок після прожарювання, мікробіологічні межі та бактеріальні ендотоксини. Документ про лабораторне тестування кожної партії публікується, а вибір постачальника значною мірою зводиться до перевірки, чи існує такий документ і що саме він охоплює.

Одна оборотна пара. Кілька шляхів, що з неї виходять. Саме шлях визначає, яке твердження можна робити. :::