Експерименти, що пов’язали метиленовий синій із клітинним диханням

Дефібринована кров людини, яку протягом трьох годин витримують за 37 °C, споживає близько двох відсотків кисню, що міститься в ній. Якщо перед інкубацією додати невелику кількість метиленового синього, та сама кров споживає близько шістдесяти п’яти відсотків. У самих клітинах нічого не змінилося. Змінився лише розчин.

Це число походить зі статті Джорджа Гарропа та Е. С. Гусмана Баррона з Університету Джонса Гопкінса, опублікованої 1928 року. Саме вона стала джерелом поширеного твердження, що метиленовий синій поліпшує клітинне дихання. Це твердження не хибне, але його зміст вужчий, ніж здається.

Що насправді вимірює число в таблиці

Вимірюваним показником було поглинання кисню, визначене за допомогою газового аналізу. Гарроп і Баррон фільтрували щойно взяту кров через вату за 10 °C, щоб видалити лейкоцити, насичували зразок киснем, розділяли його, додавали барвник до однієї частини й аналізували обидві після інкубації. Кількість лейкоцитів рідко перевищувала приблизно тисячу на кубічний міліметр. Споживання кисню подавали як частку початкового вмісту кисню в зразку, яка зникла.

Вони також вимірювали вуглекислий газ, і тут метод створював труднощі. Протягом першої години інкубації дефібринована кров виділяла до двох мілімолів вуглекислого газу на 100 mL з причин, не пов’язаних із досліджуваною реакцією, тому дихальні коефіцієнти для цільної крові були непридатними для використання. Лише відмиті клітини в розчині Локка давали показники, які можна було інтерпретувати; вони зосереджувалися в межах від 0.73 до 0.80 як із барвником, так і без нього.

Це не другорядна деталь. «Дихання» в цих статтях означає газообмін у закритій посудині. Різницю між споживанням кисню та виходом корисної енергії окремо розглянуто в матеріалі що споживання кисню говорить і чого не говорить про АТФ.

Барвник давав найбільший приріст там, де клітини дихали найменше

У зрілих еритроцитів ссавців майже немає вимірюваного споживання кисню. У ядерних еритроцитів птахів воно є. Гарроп і Баррон досліджували обидва типи, і цей контраст становить основу їхньої аргументації.

У зразках ссавців барвник спричиняв зростання у двадцять–п’ятдесят разів. У гусячій крові, клітини якої вже дихали, швидкість ніколи не зростала більш ніж удвічі. Що вищим було початкове дихання, то менше міг додати барвник.

Такий самий градієнт простежується і в межах одного виду. Зразок крові людини з істинною поліцитемією, що містив незрілі клітини, без барвника споживав 11.3 відсотка свого кисню, тоді як відмиті клітини здорового донора — 2.8 відсотка. Барвник підвищив цей показник лише до 63.4 відсотка: прискорення було шестикратним, тоді як у нормальних клітин — майже тридцятикратним. Барвник наближав поведінку зрілих клітин до поведінки незрілих — саме так автори й описували його дію.

Ціанід мав би це зупинити

Було відомо, що ціанід зупиняє клітинне окиснення. Проте Гарроп і Баррон додали його разом із барвником.

Результати для крові великої рогатої худоби є показовими. Без жодних добавок вміст кисню за три години знижувався з 22.61 до 22.03 об’ємного відсотка. З метиленовим синім він знижувався до 12.84. З метиленовим синім і ціанідом калію в концентрації одна п’ятитисячна моля на літр — до 12.74. Дія барвника практично не змінилася.

Рисунок: безперервний мікрореспірометричний запис для еритроцитів людини. Стрілка позначає додавання метиленового синього. До цього крива майже горизонтальна; після цього вона рівномірно піднімається. Відтворено зі статті Гарропа й Баррона, Journal of Experimental Medicine 48:207–223 (1928), PMID 19869478.

Вони дійшли висновку, що барвник діє як переносник кисню, «надаючи речовину, яка зникла з без’ядерних еритроцитів дорослих ссавців». Через два роки Міхаеліс і Саломон із Рокфеллерівського інституту сформулювали розбіжність так, що вона збереглася надалі. Або дія барвника була «випадковою властивістю барвника», або він був «моделлю якоїсь невідомої речовини в організмах». Цю дилему досі не розв’язано. Змінилося те, що тепер клітини можна описати значно точніше.

Екстракт печінки діяв так само

Міхаеліс і Саломон показали, що екстракти органів, отримані холодною водою, спричиняють таку саму стимуляцію. Найсильніше діяла печінка щура, далі — нирка, селезінка та яєчко. Мозок, м’язи й сироватка крові мали незначний ефект або не мали його взагалі.

Потім вони перевірили дію екстракту за наявності монооксиду вуглецю. Дихання, спричинене екстрактом або барвником, не змінювалося в суміші 98 відсотків монооксиду вуглецю та 2 відсотків кисню. Та сама газова суміш пригнічувала дихання дріжджів і ядерних еритроцитів свійських птахів приблизно на 60–80 відсотків, що узгоджувалося з описом Варбурга дихального ферменту, чутливого до монооксиду вуглецю. Отже, невідома тканинна речовина не була ферментом Варбурга.

У процесі відкинули кілька припущень щодо її природи. Відновлений глутатіон і цистеїн спричиняли лише те споживання кисню, яке було потрібне для їхнього власного окиснення. Коензим Гардена й Янга виключили, оскільки найбільше його міститься в м’язах, а вони демонстрували чи не найслабший ефект. Цитохром Кейліна, названий кількома роками раніше, зіткнувся з тією самою суперечністю. Власне припущення, що активна речовина походить із клітинного ядра, автори назвали лише припущенням.

Ефект залежав від певних умов

Клітини мали бути цілими. Гемоліз під дією дистильованої води або повторного заморожування усував реакцію і на барвник, і на екстракт, а частковий гемоліз пропорційно її зменшував.

Потрібен був і цукор. Глюкоза, фруктоза та сахароза підтримували дихання, спричинене барвником; манітол — ні. Без цукру дихання не було взагалі, і, схоже, барвник у цьому процесі пошкоджував клітини, тому глюкоза, додана через одну або дві години, його не відновлювала. Автори припустили, що барвник окиснював структурний компонент, потрібний клітині.

Освітлення значно посилювало дію барвника, хоча ефект був виразним і в темряві. Інші барвники, здатні до відновлення, поводилися інакше: толуіленовий синій діяв так само або сильніше за метиленовий синій, тоді як індигодисульфонат майже не діяв. Чіткого зв’язку між окисно-відновним потенціалом барвника та величиною його ефекту не виявили; автори пояснювали це проникністю мембран і токсичністю.

Ефект відповідав бродінню, а не диханню

У дослідженні 1930 року Баррон перейшов від клітинних суспензій до зрізів тканин нормальних органів щура та трансплантованих пухлин.

У тканинах без аеробного гліколізу метиленовий синій не діяв або трохи пригнічував споживання кисню: у нирці приблизно на 14 відсотків, у підшлунковій залозі приблизно на 14 відсотків, у печінці приблизно на 5 відсотків. У тканинах, де бродіння відбувається за наявності кисню, він підвищував споживання: у селезінці приблизно на 8 відсотків, у мозку приблизно на 13 відсотків. У пухлинах приріст становив від приблизно 27 відсотків у карциномі молочної залози людини до понад 80 відсотків у саркомі Рауса в курки, приблизно пропорційно аеробному гліколізу кожної тканини.

Рисунок: кожна точка відповідає одному типу тканини. Горизонтальна вісь — аеробний гліколіз; вертикальна — зміна споживання кисню після додавання метиленового синього. Дані зі статті Баррона, Journal of Experimental Medicine 52:447–456 (1930), таблиця 6, PMID 19869777.

Потім дослід із ціанідом дав дзеркальну картину. Коли дихання в тих тканинах, які раніше не реагували, блокували ціанідом і бродіння виходило на передній план, барвник знову підвищував споживання кисню: у нирці приблизно на 59 відсотків, у печінці приблизно на 19 відсотків, у селезінці приблизно на 286 відсотків, у яєчку приблизно на 200 відсотків.

Баррон запропонував використовувати барвник як тест на здатність клітини чи тканини до бродіння й завершив статтю припущенням: можливо, багато поколінь культивування пухлини в середовищі з барвником колись зроблять її метаболізм назавжди подібним до метаболізму нормальної тканини. Це було дослідницьке питання, сформульоване 1930 року. Це не твердження про лікування.

Чого ці експерименти не могли вимірювати

У 1928 і 1930 роках «дихання» означало споживання кисню. Про аденозинтрифосфат уперше повідомили 1929 року, а здатність ізольованих мітохондрій естерифікувати фосфат під час перенесення електронів продемонстрували 1949 року. Жодна з ранніх робіт про метиленовий синій не могла вимірювати вироблення енергії, і жодна цього не стверджувала.

Друга проблема — самі клітини. Зрілі еритроцити ссавців не містять мітохондрій. На стадії ретикулоцита вони видаляють мітохондрії та рибосоми шляхом селективної аутофагії. Тому зрілий еритроцит отримує енергію завдяки гліколізу, а його залежність від пентозофосфатного шляху пов’язана переважно з NADPH, а не з АТФ. У дослідах 1928 року не було ланцюга перенесення електронів, який можна було б відновити. Те, що споживало кисень, робило щось інше.

Тепер це «щось інше» описано досить добре. Метиленовий синій приймає електрони від клітинних відновних еквівалентів і перетворюється на лейкометиленовий синій, який знову окиснюється молекулярним киснем, замикаючи цикл. В еритроцитах людини етап відновлення здійснюють NADPH-залежна флавінредуктаза та споріднені дисульфідредуктази. Дослідження 1976 року з використанням міченої глюкози показало, що барвник стимулює гексозомонофосфатний шунт, що ефект за низької концентрації залежить від оксигемоглобіну, а за вищої концентрації, 0.1 mM, утворюється перекис водню. Відновлений барвник, взаємодіючи з киснем, утворює перекис, а не фосфатні зв’язки.

У мітохондріях картина більш спірна, ніж визнають популярні огляди. Згідно з одним напрямом досліджень, барвник забирає електрони з ділянки комплексу I й передає їх цитохрому c. Інші дослідники виявили, що в мітохондріях мозку миші він не може відновити дихання після блокування антиміцином, і натомість визначили місцем приймання електронів ділянку зв’язування убіхінолу в комплексі III. Ще одне дослідження показало, що низькі концентрації підвищували споживання кисню в стані спокою, не змінюючи дихання, стимульованого АДФ. Найпряміше суть можна сформулювати так: споживання кисню, спричинене метиленовим синім, узагалі не залежить від окисного фосфорилювання — воно зберігалося за пригнічення дихального ланцюга та в препаратах, де такого ланцюга не було.

Є й прямі вимірювання розбіжності між цими двома величинами. В ізольованих мітохондріях печінки щура підвищення концентрації барвника знижувало коефіцієнти дихального контролю та спричиняло набухання, яке автори описали як роз’єднання окисного фосфорилювання. У перфузованій печінці щура метиленовий синій підвищував споживання кисню, тоді як співвідношення АТФ до АДФ знижувалося.

Клінічні дані вказують на те саме. Метгемоглобінемію лікують внутрішньовенним введенням приблизно одного–двох міліграмів метиленового синього на кілограм через NADPH-залежний шлях відновлення, а більші дози спричиняють той самий стан, який лікують. У тому самому огляді зазначено, що антидотний ефект найсильніший у цілих еритроцитах і слабшає за наявності гемолізу. Це спостереження щодо гемолізу з 1930 року, яке через сімдесят три роки знову з’явилося вже в лікарняному контексті. Для сполуки, корисні та шкідливі ефекти якої лежать по різні боки порогової дози, не слід визначати дозу за результатами вимірювання споживання кисню.

Чому партія має значення в цій дискусії

Гарроп і Баррон помітили дещо, що варто перечитати. Сам метиленовий синій створює в спектроскопі смугу між двома характерними смугами метгемоглобіну, «що легко може спричинити плутанину за побіжного огляду». Барвник може імітувати речовину, яку шукають.

Та сама проблема має й хімічний вимір. Споріднений фенотіазин, присутній як мінорний компонент, має власні окисно-відновні властивості, власну проникність і власну токсичність. Один задокументований випадок наочно показує, що стоїть на кону: у дослідженні йодування метиленового синього зразки, що містили приблизно 7–8 відсотків Azure B, утворювали переважно йодований Azure B, тож у реакції домінувала домішка, а не метиленовий синій.

Кожен, хто використовує метиленовий синій як реагент — у лабораторії, під час фарбування препаратів чи в акваріумі, — працює з компонентом невизначеного складу, якщо партію не було охарактеризовано. Споріднені речовини, ідентичність, елементні домішки, залишкові розчинники та залишок після прожарювання — це частина експерименту, а не просто супровідна документація. Blupreme отримує метиленовий синій від фармацевтичного виробника й публікує повний сертифікат аналізу, перевіряючи відповідність усій специфікації USP, а не лише вміст важких металів; посібник із читання сертифіката аналізу та матеріал про те, що підтверджує і чого не підтверджує позначення якості USP пояснюють, як зіставити документ із заявленими характеристиками.

Число було правильним

Експерименти 1928 і 1930 років були ретельними, і їхнє головне спостереження витримало перевірку часом: барвник, здатний до відновлення, може змусити клітину, яка майже не дихає, споживати кисень зі швидкістю, що багаторазово перевищує її рівень у стані спокою, оминаючи етап, який блокує ціанід.

Помилка виникає пізніше, коли «дихання» розуміють у сучасному значенні. Вимірювання газообміну говорить, що електрони досягли кисню. Воно не говорить, що якісь із них було використано для утворення АТФ, а в клітині без мітохондрій відстань між цими двома твердженнями є максимальною. Ширша карта дії метиленового синього в клітинах розглядає ту саму відмінність у ширшому контексті, а історія сполуки від барвника до лікарського засобу пояснює, як текстильний барвник узагалі потрапив у ці експерименти.