Metilen mavisini hücresel solunumla ilişkilendiren deneyler

Üç saat boyunca 37 °C'de tutulan defibrine edilmiş insan kanı, içerdiği oksijenin yaklaşık yüzde ikisini tüketir. İnkübasyondan önce az miktarda metilen mavisi eklendiğinde ise aynı kan yaklaşık yüzde altmış beşini tüketir. Hücrelerde hiçbir şey değişmemiştir. Yalnızca çözelti değişmiştir.

Bu sayı, Johns Hopkins'te George Harrop ve E. S. Guzman Barron tarafından yayımlanan 1928 tarihli bir makaleden gelir ve metilen mavisinin hücresel solunumu iyileştirdiğine ilişkin sıkça tekrarlanan ifadenin kaynağıdır. Bu ifade yanlış değildir; ancak kapsamı, kulağa geldiğinden daha dardır.

Tablodaki sayı gerçekte neyi ölçüyor?

Ölçülen sonlanım noktası, gaz analiziyle belirlenen oksijen alımıydı. Harrop ve Barron, akyuvarları uzaklaştırmak için yeni alınmış kanı 10 °C'de pamuktan süzdüler, örneği oksijenle doyurdular, ikiye ayırdılar, bir kısmına boya eklediler ve inkübasyondan sonra her iki kısmı da analiz ettiler. Lökosit sayıları nadiren milimetreküp başına yaklaşık bini aşıyordu. Oksijen tüketimi, örneğin başlangıçtaki oksijen içeriğinin kaybolan payı olarak bildirildi.

Karbondioksiti de ölçtüler, ancak bu noktada yöntem sorun çıkardı. Defibrine edilmiş kan, incelenen reaksiyonla ilgisi olmayan nedenlerle inkübasyonun ilk saatinde 100 mL başına iki milimole kadar karbondioksit salıyordu; bu yüzden tam kandan elde edilen solunum katsayıları kullanılamıyordu. Yalnızca Locke çözeltisindeki yıkanmış hücreler yorumlanabilir değerler verdi ve bu değerler, boya varlığında da yokluğunda da 0.73 ile 0.80 arasında toplandı.

Bu ayrıntı önemsiz değildir. Bu makalelerde “solunum”, kapalı bir kaptaki gaz alışverişi anlamına gelir. Oksijen tüketimi ile kullanılabilir enerji üretimi arasındaki fark, oksijen tüketiminin ATP hakkında ne söylediği ve ne söylemediği başlıklı yazıda ayrıca incelenir.

Boya, en az solunum yapan hücrelerde en büyük artışı sağladı

Olgun memeli eritrositlerinde ölçülebilir oksijen tüketimi neredeyse yoktur. Çekirdekli kuş eritrositlerinde ise vardır. Harrop ve Barron her ikisini de inceledi ve aralarındaki karşıtlık, savlarının temelini oluşturdu.

Memeli örneklerinde boya, yirmi ila elli kat artış sağladı. Hücreleri zaten solunum yapan kaz kanında ise hızı hiçbir zaman iki katından fazla artırmadı. Başlangıçtaki solunum ne kadar yüksekse boyanın sağlayabildiği ek artış o kadar azdı.

Aynı eğilim, tek bir tür içinde de görülür. Polisitemia vera hastası bir kişiden alınan ve olgunlaşmamış hücreler içeren insan kanı örneği, boya yokken oksijeninin yüzde 11.3'ünü tüketirken sağlıklı bir donörden alınan yıkanmış hücrelerde bu oran yüzde 2.8'di. Boya, ilk örnekteki oranı yalnızca yüzde 63.4'e çıkardı; normal hücrelerde hızlanma yaklaşık otuz katken burada altı kat oldu. Boya, olgun hücreleri olgunlaşmamış hücrelerin davranışına yaklaştırıyordu; yazarlar da yaptığı şeyin bu olduğunu söylüyordu.

Siyanürün bunu durdurması gerekirdi

Siyanürün hücresel oksidasyonu durdurduğu biliniyordu. Harrop ve Barron buna rağmen boyayla birlikte siyanür de ekledi.

Sığır kanındaki sonuçlar, genel tabloyu temsil eder. Hiçbir şey eklenmediğinde oksijen içeriği üç saat içinde hacimce yüzde 22.61'den 22.03'e düştü. Metilen mavisiyle 12.84'e indi. Metilen mavisi ve beş binde bir molar potasyum siyanürle ise 12.74'e düştü. Boyanın etkisi esasen değişmemişti.

Şekil: insan eritrositlerinin kesintisiz mikrosolunum kaydı. Ok, metilen mavisinin eklendiği anı gösterir. Öncesinde eğri neredeyse düzdür; sonrasında düzenli olarak yükselir. Harrop ve Barron, Journal of Experimental Medicine 48:207–223 (1928), PMID 19869478 kaynağından alınmıştır.

Vardıkları sonuç, boyanın bir oksijen taşıyıcısı olarak işlev gördüğü, “erişkin memelilerin çekirdeksiz eritrositlerinden kaybolmuş bir maddeyi sağladığı” yönündeydi. İki yıl sonra Rockefeller Enstitüsü'nden Michaelis ve Salomon, görüş ayrılığını kalıcı biçimiyle ortaya koydu. Boyanın etkisi ya “boyanın rastlantısal bir özelliğiydi” ya da boya “organizmalardaki bilinmeyen bir maddenin modeliydi”. Bu iki olasılık arasındaki ayrım hâlâ çözüme kavuşmuş değil. Değişen şey, hücrelerin artık çok daha kesin biçimde tanımlanabilmesi.

Bir karaciğer özütü de aynı şeyi yaptı

Michaelis ve Salomon, organlardan soğuk suyla hazırlanan özütlerin aynı uyarıcı etkiyi oluşturduğunu gösterdi. En güçlü etki sıçan karaciğerinde görüldü; onu böbrek, dalak ve testis izledi. Beyin, kas ve kan serumunun etkisi çok azdı ya da hiç yoktu.

Ardından özütü karbonmonoksit varlığında test ettiler. Özütün veya boyanın başlattığı solunum, yüzde 98 karbonmonoksit ve yüzde 2 oksijen karışımında değişmedi. Aynı gaz karışımı, Warburg'un karbonmonoksite duyarlı bir solunum enzimi açıklamasıyla uyumlu olarak maya solunumunu ve çekirdekli tavuk eritrositlerinin solunumunu yaklaşık yüzde 60 ila 80 oranında engelledi. Dolayısıyla kimliği belirlenmemiş doku maddesi, Warburg'un enzimi değildi.

Süreç içinde, maddenin kimliğine ilişkin birkaç aday elendi. İndirgenmiş glutatyon ve sistein, yalnızca kendi oksidasyonlarının gerektirdiği kadar oksijen tüketimi oluşturdu. Harden ve Young'ın koenzimi elendi; çünkü en fazla kas dokusunda bulunuyordu, oysa kas neredeyse en az etkiyi göstermişti. Birkaç yıl önce adlandırılan Keilin'in sitokromu da aynı çelişkiyle karşılaştı. Etkin maddenin hücre çekirdeğinden geldiği yönündeki kendi önerilerini ise yalnızca bir öneri olarak nitelendirdiler.

Etki belirli koşullara bağlıydı

Hücrelerin bütünlüğünü koruması gerekiyordu. Damıtılmış suyla veya tekrarlanan dondurma işlemleriyle oluşturulan hemoliz, hem boyaya hem de özüte verilen yanıtı ortadan kaldırdı; kısmi hemoliz ise yanıtı kendi oranında azalttı.

Şeker de gerekliydi. Glikoz, fruktoz ve sakkaroz, boyanın başlattığı solunumu destekledi; mannitol desteklemedi. Şeker yokken hiç solunum gerçekleşmedi ve boya bu süreçte hücrelere zarar veriyor gibi görünüyordu; bu nedenle bir veya iki saat sonra eklenen glikoz solunumu geri getirmedi. Yazarlar, boyanın hücrenin ihtiyaç duyduğu yapısal bir bileşeni oksitlediğini öne sürdü.

Işık, boyanın etkisini belirgin ölçüde artırdı; ancak etki karanlıkta da açıkça görülüyordu. İndirgenebilir diğer boyalar farklı davranıyordu: toluilen mavisi, metilen mavisine eşit veya ondan daha güçlü bir etki gösterirken indigo disülfonat neredeyse hiçbir şey yapmadı. Bir boyanın oksidasyon-redüksiyon potansiyeli ile etkisinin büyüklüğü arasında belirgin bir ilişki ortaya çıkmadı; yazarlar bunu zar geçirgenliğine ve toksisiteye bağladı.

Etki, solunumu değil fermantasyonu izliyordu

Barron'un 1930 tarihli çalışması, hücre süspansiyonlarından normal sıçan organlarının ve nakledilmiş tümörlerin doku kesitlerine geçti.

Aerobik glikoliz görülmeyen dokularda metilen mavisi ya hiçbir şey yapmadı ya da oksijen tüketimini hafifçe baskıladı: böbrekte yaklaşık yüzde 14, pankreasta yaklaşık yüzde 14, karaciğerde yaklaşık yüzde 5. Oksijen varlığında fermantasyon yapan dokularda ise tüketimi artırdı: dalakta yaklaşık yüzde 8, beyinde yaklaşık yüzde 13. Tümörlerdeki artışlar, her dokunun aerobik glikoliziyle kabaca orantılı olarak, bir insan meme karsinomunda yaklaşık yüzde 27'den bir Rous tavuk sarkomunda yüzde 80'in üzerine kadar uzandı.

Şekil: her nokta bir doku türünü temsil eder. Yatay eksen aerobik glikolizi, dikey eksen ise metilen mavisi sonrasında oksijen tüketimindeki değişimi gösterir. Veriler Barron, Journal of Experimental Medicine 52:447–456 (1930), Tablo 6, PMID 19869777 kaynağından alınmıştır.

Ardından siyanür deneyi, bunun ayna görüntüsünü ortaya koydu. Daha önce yanıt vermeyen bu dokularda solunum siyanürle engellenip fermantasyon belirginleştiğinde boya oksijen tüketimini yeniden artırdı: böbrekte yaklaşık yüzde 59, karaciğerde yaklaşık yüzde 19, dalakta yaklaşık yüzde 286, testiste yaklaşık yüzde 200.

Barron, boyanın bir hücrenin veya dokunun fermantasyon kapasitesini ölçen bir test olarak kullanılabileceğini öne sürdü ve yazısını bir varsayımla bitirdi: boya içeren ortamda nesiller boyunca tümör kültürü yapmak, bir gün tümörün metabolizmasını kalıcı olarak normal dokununkine benzetebilirdi. Bu, 1930'da yazılmış bir araştırma sorusuydu. Bir tedavi iddiası değildir.

Deneylerin ölçmüş olamayacağı şeyler

1928 ve 1930'da “solunum”, oksijen tüketimi anlamına geliyordu. Adenozin trifosfat ilk kez 1929'da bildirildi; izole mitokondrilerin elektron aktarırken fosfatı esterleştirdiğinin gösterilmesi ise 1949'da gerçekleşti. Metilen mavisiyle ilgili ilk makalelerin hiçbiri enerji üretimini ölçmüş olamazdı ve hiçbiri bunu yaptığını iddia etmedi.

İkinci sorun hücrelerdir. Olgun memeli eritrositleri mitokondri içermez. Retikülosit evresinde mitokondrilerini ve ribozomlarını seçici otofaji yoluyla ortadan kaldırırlar. Bu nedenle olgun bir alyuvar glikolizle çalışır ve pentoz fosfat yoluna ATP'den ziyade esas olarak NADPH için ihtiyaç duyar. 1928 deneylerinde onarılabilecek bir elektron taşıma zinciri yoktu. Oksijeni tüketen şey her neyse, başka bir iş yapıyordu.

Bu başka işin ne olduğu artık oldukça iyi tanımlanmış durumda. Metilen mavisi, hücresel indirgen eşdeğerlerden elektron alarak lökometilen mavisine dönüşür; bu madde moleküler oksijen tarafından yeniden oksitlenir ve döngü tamamlanır. İnsan alyuvarlarında indirgenme adımını NADPH'ye bağımlı flavin redüktaz ve ilişkili disülfit redüktazlar gerçekleştirir. İşaretli glikoz kullanılan 1976 tarihli bir çalışma, boyanın heksoz monofosfat şantını uyardığını, düşük konsantrasyondaki etkinin oksihemoglobine bağlı olduğunu ve daha yüksek bir konsantrasyonun, 0.1 mM'nin, hidrojen peroksit oluşturduğunu buldu. Oksijenle karşılaşan indirgenmiş bir boya, fosfat bağları değil peroksit üretir.

Mitokondrilerdeki tablo, popüler özetlerin kabul ettiğinden daha tartışmalıdır. Bir araştırma çizgisine göre boya, kompleks I bölgesinden elektron alıp sitokrom c'ye aktarır. Başka bir çalışma, fare beyni mitokondrilerinde antimisinin oluşturduğu blokajdan sonra solunumu geri getiremediğini buldu ve elektron alıcısını bunun yerine kompleks III'ün ubikinol bağlanma bölgesine yerleştirdi. Üçüncü bir çalışma ise düşük konsantrasyonların, ADP ile uyarılan solunumu değiştirmeden dinlenim durumundaki oksijen tüketimini artırdığını buldu. Bu konudaki en doğrudan ifade, metilen mavisinin başlattığı oksijen tüketiminin oksidatif fosforilasyona hiç bağlı olmadığıdır: solunum zinciri inhibe edildiğinde de solunum zinciri içermeyen preparatlarda da devam etmiştir.

Bu iki büyüklük arasındaki farkın doğrudan ölçümleri de vardır. İzole sıçan karaciğeri mitokondrilerinde artan boya konsantrasyonları solunum kontrol oranlarını düşürmüş ve şişmeye neden olmuştur; yazarlar bunu oksidatif fosforilasyonun ayrışması olarak tanımlamıştır. Perfüze sıçan karaciğerinde metilen mavisi oksijen tüketimini artırırken ATP/ADP oranı düşmüştür.

Klinik bulgular da aynı mesajı verir. Methemoglobinemi, NADPH'ye bağımlı bir indirgenme yolu üzerinden, kilogram başına yaklaşık bir ila iki miligram metilen mavisinin intravenöz uygulanmasıyla tedavi edilir; daha yüksek dozlar ise tedavi edilen durumun kendisine neden olur. Aynı derleme, antidot etkisinin bütünlüğünü koruyan eritrositlerde en yüksek olduğunu ve hemoliz varlığında azaldığını belirtir. Bu, 1930'daki hemoliz bulgusunun yetmiş üç yıl sonra hastane ortamında yeniden ortaya çıkmasıdır. Yararlı ve zararlı etkileri bir doz eşiğinin karşı taraflarında bulunan bir bileşiğin dozu, oksijen tüketimi ölçümünden çıkarılmamalıdır.

Üretim partisi neden tartışmanın bir parçası?

Harrop ve Barron, tekrar okumaya değer bir şey fark etti. Metilen mavisinin kendisi spektroskopta methemoglobinin iki karakteristik bandı arasında bir bant oluşturur ve bu, “yüzeysel bir incelemede kolayca karışıklığa yol açabilir”. Boya, aranan maddeyi taklit edebilir.

Aynı sorunun kimyasal bir biçimi de vardır. Az miktarda bileşen olarak bulunan ilişkili bir fenotiyazinin kendine özgü redoks davranışı, geçirgenliği ve toksisitesi vardır. Belgelenmiş bir örnek, bunun önemini somutlaştırır: metilen mavisinin iyotlanmasına ilişkin bir çalışmada yaklaşık yüzde 7 ila 8 Azure B içeren örnekler çoğunlukla iyotlanmış Azure B üretmiştir; dolayısıyla reaksiyona metilen mavisi değil safsızlık hâkim olmuştur.

Metilen mavisini laboratuvarda, boyama tezgâhında veya akvaryumda reaktif olarak kullanan herkes, üretim partisi karakterize edilmediği sürece özellikleri belirlenmemiş bir bileşenle çalışıyor demektir. İlişkili maddeler, kimlik, elementel safsızlıklar, kalıntı çözücüler ve yakma kalıntısı, deneyin çevresindeki evrak işleri değil, deneyin bir parçasıdır. Blupreme, metilen mavisini bir ilaç üreticisinden temin eder ve yalnızca ağır metalleri değil, USP spesifikasyonunun tamamını test ederek kapsamlı bir analiz sertifikası yayımlar; analiz sertifikası okuma kılavuzu ve USP sınıfı tanımının neyi ortaya koyduğu ve neyi koymadığı başlıklı yazılar, belgenin iddiayla nasıl karşılaştırılacağını ele alır.

Sayı doğruydu

1928 ve 1930 deneyleri titizlikle yapılmıştı ve temel gözlemleri geçerliliğini korudu: indirgenebilir bir boya, neredeyse hiç solunum yapmayan bir hücrenin, siyanürün engellediği adımdan geçmeden dinlenim hızının kat kat üzerinde oksijen tüketmesini sağlayabilir.

Hata daha sonra, “solunum” sözcüğü modern anlamıyla okunduğunda ortaya çıkar. Bir gaz alışverişi ölçümü, elektronların oksijene ulaştığını söyler. Bu elektronlardan herhangi birinin ATP üretmek için kullanıldığını söylemez; mitokondrisi olmayan bir hücrede bu iki ifade arasındaki mesafe olabilecek en geniş düzeydedir. Metilen mavisinin hücrelerde ne yaptığına ilişkin daha geniş harita aynı ayrımı daha geniş bir çerçeveye yerleştirirken bileşiğin boyadan ilaca uzanan tarihi bir tekstil boyasının en başta bu deneylere nasıl ulaştığını açıklar.