Identifikacija metilenskog plavila u laboratoriji: infracrveni spektri i dopunske metode

Zamislite da tri laboratorije dobiju isti plavi prah. Prva snimi infracrveni spektar i proglasi ga metilenskim plavilom. Druga sprovede hromatografiju i prijavi 0.4% Azure B. Treća ispita difrakciju rendgenskih zraka na kristalima i utvrdi hidratni oblik. Sve tri su u pravu, a nijedna nije odgovorila na preostala dva pitanja. Zabuna počinje kada se jedan rezultat tumači kao odgovor na sva tri.

Ovaj članak razdvaja ta pitanja. Infracrvena identifikacija potvrđuje molekulski identitet poređenjem sa referentnim standardom. Hromatografija utvrđuje sastav. Difrakcija utvrđuje oblik u čvrstom stanju. Podudaranje koje zadovoljava kriterijum identifikacije nije sertifikat o čistoći.

Infracrvena identifikacija dobro odgovara na jedno pitanje

Farmakopejsko ispitivanje identiteta metilenskog plavila zasniva se na poređenju spektra sa standardom, a ne na kontrolnoj listi pikova. U pregledu USP monografije za metilensko plavilo, Identifikacija A navodi infracrvenu spektroskopiju uz ATR optiku ili tabletu kalijum-bromida. Spektar uzorka mora odgovarati spektru USP referentnog standarda, pri čemu se uzorak i standard pripremaju i snimaju pod ekvivalentnim uslovima. Odluku ne određuje fiksna lista dijagnostičkih talasnih brojeva, već preklapanje spektara.

Takav pristup odražava ponašanje FTIR spektara metilenskog plavila. Najizraženije karakteristike nalaze se u oblasti otiska prsta. U literaturi se glavna traka konjugovanog prstena dosledno pripisuje oblasti oko 1590 do 1600 cm-1, gde se sprežu vibracije istezanja aromatičnih veza ugljenik–ugljenik i ugljenik–azot. Dodatne trake oko 1490 i 1390 cm-1 imaju karakter deformacionih vibracija prstena i veza ugljenik–azot i ugljenik–vodonik. Trake oko 1355 i 1330 cm-1 uključuju veze ugljenik–azot dimetilamino grupa i deformacije metil grupa. Karakteristike oko 1225 do 1250 cm-1 pripadaju heterocikličnom skeletu, dok trake oko 1170 do 1130 i 1066 cm-1 imaju karakter vibracija ugljenik–sumpor, uz savijanje aromatičnih C-H veza oko 880 cm-1. Vibracije istezanja javljaju se pri višim talasnim brojevima: aromatične C-H oko 3040 cm-1 i N-metil C-H približno između 2900 i 3000 cm-1. Objavljena pripisivanja traka razlikuju se u detaljima jer fenotijazinijumski skelet vibrira kao spregnuti sistem, pa svaku pojedinačnu tabelu pripisivanja posmatrajte kao opis iz određenog izvora, a ne kao jedino moguće tumačenje.

Dva efekta pripreme zaslužuju pažnju jer menjaju IR spektre metilenskog plavila bez promene same boje. Prvo, hidratizovani materijal pokazuje široku O-H traku oko 3300 do 3500 cm-1 i vibraciju savijanja vode oko 1630 do 1640 cm-1, a različiti hidratni oblici merljivo pomeraju trake u oblasti otiska prsta. Drugo, matrica KBr tablete je higroskopna: apsorbovana vlaga stvara trake upravo u tim oblastima vode i može se pogrešno protumačiti kao hidratna voda iz uzorka. ATR merenje izbegava KBr matricu, ali ATR intenziteti zavise od dubine prodiranja, koja se menja sa talasnim brojem, pa se ATR spektar i transmisioni spektar istog praha ne mogu direktno preklopiti. Praktično pravilo proizlazi iz farmakopejskog zahteva: uporedite uzorak i referentni standard snimljene istom tehnikom i dokumentujte koja je tehnika korišćena. Za osnovnu hemiju katjona, soli i hidrata koji stoje iza ovih spektara pogledajte referentni pregled strukture i svojstava metilenskog plavila.

Tabela za izbor analitičke metode

Ova tabela služi za izbor metode. Čitajte svaki red da biste saznali na koje pitanje metoda odgovara, šta potvrđuje rezultat koji zadovoljava kriterijume i šta ostaje nedokazano.

Zašto podudaranje infracrvenih spektara nije sertifikat o čistoći

Podudaranje pri identifikaciji isključuje pogrešnu boju. Ono ne daje popis svih sastojaka uzorka. Tri ograničenja su najvažnija.

Prvo, srodna jedinjenja izgledaju slično u infracrvenom području. Azure B se od metilenskog plavila razlikuje za samo jednu metil grupu, pa njegov spektar veoma liči na spektar metilenskog plavila. Smeša koja sadrži nekoliko procenata Azure B i dalje se dobro preklapa sa referentnim spektrom metilenskog plavila. Otkrivanje te nečistoće zadatak je hromatografije, opisan u vodiču za nečistoće metilenskog plavila i metode ispitivanja.

Drugo, infracrvena spektroskopija je tehnika koja posmatra uzorak kao celinu i ima ograničenu osetljivost na komponente prisutne u malim količinama. Male količine srodnih boja, rezidualnih rastvarača ili neorganskih ostataka skrivaju se ispod glavnih traka. Odsustvo dodatnih pikova slab je dokaz odsustva nečistoća.

Treće, referentni standard određuje čitavo poređenje. Degradiran standard, standard sa spektralnim pomeranjima usled hidratacije ili standard kojim se nepravilno rukovalo menja osnovu procene. Isto važi i za neusaglašene tehnike, na primer kada se ATR spektar uzorka ocenjuje prema KBr referentnom spektru. Uz svaki zaključak zabeležite seriju standarda, tehniku i način pripreme.

Smeše zahtevaju još jedan oprez. Spektar koji se uglavnom podudara, ali ima ramena ili anomalije intenziteta, nije pozitivan rezultat uz fusnote. To je znak da komponente uzorka treba razdvojiti pre identifikacije.

Dopunske metode u praksi

HPLC metilenskog plavila daje odgovor o sastavu koji infracrvena spektroskopija ne može da pruži. Važeća farmakopejska metoda koristi kolonu fenilnog tipa sa gradijentom voda–acetonitril koji sadrži trifluorosirćetnu kiselinu i detekciju na 246 nm, a ne u vidljivom području. Identitet se utvrđuje na osnovu podudaranja retencionog vremena sa referentnim standardom; isto poređenje služi i za određivanje sadržaja. U ispitivanju organskih nečistoća Azure B se identifikuje pomoću sopstvenog referentnog materijala, pri relativnoj retenciji oko 0.8 u odnosu na metilensko plavilo na 1.0, uz zahtev za visokom rezolucijom između ta dva pika. Obratite pažnju na izbor talasne dužine: niz demetilovanih boja apsorbuje na talasnim dužinama koje se postepeno pomeraju ka crvenom delu spektra, od tionina oko 600 nm, preko Azure C, Azure A i Azure B, do metilenskog plavila oko 670 nm. Detektor podešen na približno 660 nm zato ne reaguje podjednako na sve članove niza i potcenjuje količinu nekih homologa. Kada je potrebno potpuno profilisanje celog niza, treba koristiti C18 LC-MS/MS metodu sa kvalifikovanim standardima za svaki analit.

Difrakcija praha odgovara na pitanje o čvrstom stanju čije informacije obe prethodne metode uništavaju ili zanemaruju: rastvaranje praha za hromatografiju briše informacije o kristalima, a molekulske vibracije govore o vezama, a ne o uređenju dugog dometa. Difrakcioni obrasci razlikuju hidratne faze i kristaliničnost, a metilenskom plavilu je takva provera potrebnija nego većini materijala. Istraživanjem čvrstog stanja Rager i saradnici identifikovali su pet različitih hidratnih struktura, uključujući pentahidrat, dva dihidrata, monohidrat i intermedijarni hidrat, a među okarakterisanim oblicima nisu pronašli pravi trihidrat. Laboratorijsko rukovanje je ovde važno: vlažnost i temperatura menjaju stabilnost hidrata, a intenzivno mlevenje može promeniti fazu ili smanjiti kristaliničnost. Zato kontrolišite i dokumentujte relativnu vlažnost i temperaturu i svedite mlevenje na minimum. Označavanje hidrata i njegov uticaj na odmerenu masu dodatno su objašnjeni u članku o hidratnim oblicima metilenskog plavila i njihovom označavanju.

UV-Vis apsorpcija ima dopunsku ulogu. Poznati maksimumi potvrđuju očekivano ponašanje rastvora i omogućavaju određivanje koncentracije, ali plavi rastvor koji apsorbuje na očekivanoj talasnoj dužini samo je u skladu sa metilenskim plavilom, ne i dokaz njegovog identiteta, jer srodne boje apsorbuju u bliskim oblastima.

Šta pitati pre kupovine

Pretvorite ove razlike u pitanja pri kupovini. Pitajte koja je serija ispitana, kojom tehnikom je potvrđen identitet, da li je HPLC ispitivanje nečistoća koristilo referentni materijal Azure B i da li je hidratni oblik okarakterisan ili pretpostavljen. Pre svega, pitajte da li sertifikat pokriva celu specifikaciju ili samo odabrana ispitivanja. Mnogi prodavci koji tvrde da proizvod ispunjava farmakopejske zahteve ispituju samo teške metale, čime pitanja identiteta, sadržaja, organskih nečistoća, rastvarača i mikrobioloških parametara ostaju bez odgovora.

Blupreme ispituje celu USP specifikaciju, koja obuhvata identitet, čistoću, organske nečistoće, rezidualne rastvarače, elementarne nečistoće, ostatak nakon žarenja, mikrobiološke granice i bakterijske endotoksine, u saradnji sa farmaceutskim proizvođačem metilenskog plavila. Javni sertifikat analize za svaku seriju objavljuje se na stranici Blupreme ispitivanje kvaliteta, tako da se osnova za izračunavanje sadržaja i rezultati ispitivanja nečistoća mogu direktno pročitati, umesto da se pretpostavljaju. I uz rezultate blizu 100% mora biti navedena osnova njihovog izračunavanja, kao što objašnjava vodič za rezultate određivanja sadržaja iznad 100 procenata. Podudaranje identiteta otvara proveru. Potpuna dokumentacija je zaokružuje.