Zgodovina metilenskega modrila: od barvila do zdravila in raziskav

Metilensko modrilo je do bolnika prišlo, še preden je prišlo v lekarno.

Poročilo Paula Guttmanna in Paula Ehrlicha iz leta 1891 o uporabi barvila pri malariji vsebuje dva temperaturna grafikona. Drugi zajema obdobje od 13. julija do 5. avgusta, ob robu pa je za vsak dan zapisana uporabljena terapija. Vnosa za 18. in 19. julij se glasita »1 × 0,05 Methylenblau«. Naslednji dnevi navajajo pet in sedem odmerkov enake količine, do 22. julija pa se v zapisu pojavi tudi majhna količina kinina. Vročinska krivulja, ki v prvi polovici grafikona niha med 37 °C in 39.5 °C, se po uvedbi barvila izravna in v preostalih treh tednih ostaja med približno 36 °C in 37.5 °C.

Bolnik je bil eden od dveh; v članku sta opisana kot hišni služabnik in mornar. Spojina, ki sta jo prejela, je bila že petnajst let komercialno tekstilno barvilo, ta dva moška pa sodita med prve zabeležene ljudi, zdravljene s povsem sintetičnim zdravilom, usmerjenim proti določenemu organizmu.

Najprej je bilo barvilo

Prvo komercialno uspešno sintetično barvilo je leta 1856 ustvaril William Henry Perkin. Perkin je bil star osemnajst let, med velikonočnimi počitnicami je delal v domačem laboratoriju in poskušal sintetizirati kinin. Namesto tega je dobil črn ostanek, ga raztopil in odkril barvo, ki se je izjemno dobro vezala na svilo. Avgusta 1856 jo je patentiral, do konca leta 1857 pa je njegova tovarna že oskrbovala londonsko svilarsko barvarno.

Leta 1875 je Adolf von Baeyer sintetiziral rdeče barvilo in ga poimenoval eozin, po Eos, grški besedi za zarjo. Leta 1876 je Heinrich Caro, takratni direktor laboratorija podjetja Badische Anilin- und Soda-Fabrik, skupaj z Baeyerjem razvil metilensko modrilo kot anilinsko barvilo za bombaž. Njegova kemijska struktura je bila dokončno pojasnjena šele približno devet let pozneje.

Ta izvor je še vedno viden v poimenovanju snovi. »Methylene blue« je trgovsko ime iz kataloga barvil, ne kemijski opis. Spojina, na katero se nanaša, je metiltioninijev klorid, razlike med imenom, soljo in njenimi hidrati pa postanejo pomembne takoj, ko kdo snov tehta ali bere specifikacijo.

Barvanje preparatov je bilo most

Pot iz barvarne v bolnišnico je vodila skozi mikroskop in se je začela še pred obstojem metilenskega modrila. Wilhelm Erb je bil prvi, ki je leta 1865 na kri nanesel sintetično barvilo, pikrinsko kislino, in v nekaterih rdečih krvničkah opazil mrežast vzorec.

Doktorska disertacija Paula Ehrlicha iz leta 1878 je primerjala histološko barvanje z barvanjem tekstila in trdila, da gre v obeh primerih za kemijske reakcije. Pri delu pod vodstvom Roberta Kocha na bacilu tuberkuloze je anilinska barvila razvrstil v kisle in bazične skupine ter ugotovil, da vsaka skupina obarva različne dele celice. Leta 1880 je obe skupini zmešal: nasičeno raztopino metilenskega modrila je vlival v kisli fuksin, dokler se supernatant ni zbistril. Rezultat, ki ga je imenoval neutralen Farbkörper oziroma nevtralno barvilo, je namesto ene ustvaril tri barve, razkril granule v polimorfonuklearnih celicah, ki prej niso bile vidne, in omogočil prvo diferencialno štetje levkocitov. Ker so te granule vezale obe sestavini mešanice, je Ehrlich za celice, ki so jih vsebovale, skoval izraz nevtrofil.

Dve leti pozneje je Koch uporabil metilensko modrilo za odkrivanje bacila tuberkuloze, leta 1883 pa je Ehrlich metodo izboljšal. Leta 1886 je objavil drugačno vrsto opažanja: barvilo je vbrizgal živim živalim, primerjal, kako močno ga posamezni organi privzamejo, in sklenil, da ima izrazito afiniteto do možganskega in živčnega tkiva. To afiniteto je pripisal oksidacijsko-redukcijskemu kroženju barvila, ki ga je opazil leto prej. Zaradi tega kroženja tudi raztopina metilenskega modrila izgubi barvo, ko se porabi njen kisik, in jo znova pridobi, ko se vrne zrak. Poskusi, ki so prvi izmerili posledice tega kroženja, sodijo v poznejše desetletje, sam mehanizem pa je ločena tema od zgodovine.

Parazit in vijolično jedro

Alphonse Laveran je leta 1880 odkril povzročitelja malarije s pregledovanjem sveže, neobarvane krvi. Za rutinsko opazovanje v posušenem razmazu pa je bilo potrebno barvilo, takratna barvila pa so ustvarjala le rdečo in modro.

Leta 1888 je poljski patolog Czesław Cheçinski kisli fuksin nadomestil z eozinom in pripravil mešanico metilenskega modrila in eozina. Primer, na katerem je temeljila njegova metoda, je bil vojak, ki je 30. septembra 1887 umrl zaradi malarije. V krvnih razmazih je Cheçinski opazil modre marjeticam podobne oblike, danes prepoznane kot Plasmodium malariae, in srpaste oblike, danes prepoznane kot gametociti Plasmodium falciparum. Rezultat je hkrati odpravil dve konkurenčni razlagi bolezni: teorijo miazme ter trditev Edwina Klebsa in Corrada Tommasi-Crudelija, da malarijo povzroča bakterija.

Parazit je bil viden. Njegovo jedro pa ne, zato je njegova narava ostajala nejasna. Ernst Malachowski, zdravnik v Breslauu, je težavo najprej rešil po naključju, nato pa namerno. Leta 1889 je v preparatu opazil diferencialno obarvanje plazmodijskega jedra, vendar učinka ni mogel ponoviti. Zakisanje metilenskega modrila ni pomagalo. Ko ga je z boraksom alkaliziral, se je učinek pojavil vsakič. Tehniko je javno prikazal 15. junija 1890 in jo istega leta objavil, avgusta 1891 pa je objavil podrobnejšo metodo.

Dmitri Romanowsky je septembra 1891 objavil svojo različico. Najboljše rezultate je dobil iz zanemarjene, plesnive steklenice raztopine metilenskega modrila, stare več kot dva meseca. Malachowskijev postopek je bil nameren in po njegovih besedah zlahka ponovljiv; Romanowskyjev je bil slepa ulica, ki je delovala enkrat. Kljub temu je eponim pripadel Romanowskyju, spor o tem, kdo je ustvaril vijolično obarvanje, zaradi katerega je postalo jedro vidno, pa je ločena zgodba z lastnimi dokumenti.

Slika: drugi temperaturni grafikon iz poročila Guttmanna in Ehrlicha iz leta 1891. Zgornji del zajema obdobje od 13. do 24. julija, spodnji pa od 25. julija do 5. avgusta; vnosi ob robu navajajo uporabljene odmerke, temperatura pa v zadnjih treh tednih zapisa ostaja blizu normalne. Reproducirano iz poročila, skeniranega za Krafts, Hempelmann in Skórska-Stania, Parasitology Research 111:1–6 (2012), PMID 22411634.

Izkazalo se je, da je »zorenje« demetilacija

Nihče od sodelujočih v 1890-ih ni vedel, kaj »zorenje« naredi metilenskemu modrilu. Odgovor je prišel iz industrijske kemije. Heinrich August Bernthsen je leta 1883 sintetiziral matično spojino fenotiazin, leta 1885 ugotovil, da metilensko modrilo spada v to družino, in v istem obdobju pokazal, da alkalni pogoji iz barvila odstranjujejo metilne skupine, pri čemer nastajajo spojine, danes imenovane azuri.

Bernard Nocht je v letih 1898 in 1899 izoliral aktivno frakcijo in jo lahko poimenoval le Rot aus Methylenblau, rdeče iz metilenskega modrila. Michaelis jo je leta 1901 identificiral kot azur I. Jenner je leta 1899 uvedel absolutni metanol kot topilo za oborino barvila, s čimer je odpravil potrebo po toplotni fiksaciji krvnih razmazov; Leishman in Reuter sta združila obe izboljšavi; Wright je leta 1902 objavil poenostavljeno metodo. Giemsov prispevek, prav tako iz leta 1902, je bil, da se je prenehal zanašati na naključno zorjeno raztopino in je namesto tega uporabljal odmerjene količine znanih barvil. Nato ni želel objaviti, kako je izdeloval čisti metilenski azur, in je metodo prodal laboratoriju dr. Grüblerja, ki je izdelek tržil kot azur I ter trdil, da je samo njegova različica pristno Giemsovo barvilo.

Dve svetovni vojni sta postopek po naključju dokončali. Ko nemških barvil ni bilo več mogoče dobiti, so Lillie, Roe in Wilcox raziskovali ameriške nadomestke ter ugotovili, da najboljše obarvanje dajejo tri ločene sestavine: čisto metilensko modrilo, njegov razgradni produkt Azure B in eozin. Te tri sestavine še danes ostajajo glavne komponente barvila, ki se uporablja za diagnosticiranje malarije, pod imenom, ki zdaj združuje Malachowskega, Wrighta in Giemso.

Slika: obročaste oblike Plasmodium falciparum v človeških rdečih krvničkah, obarvane z metodo tipa Romanowsky. Vijolična struktura znotraj obroča je kromatin, ki ga je metilensko modrilo, obdelano z boraksom po Malachowskem, prvič naredilo vidnega. Slika: Ernst Hempelmann, objavljeno v javni domeni.

Eno ime, več materialov

Leta, v katerih so te sestavine ločevali, so pustila težavo, ki je preživela samo kemijo. Ralph Lillie je leta 1969 potegnil ločnico med biološkimi barvili, »izdelanimi po strogih specifikacijah, sorazmernih z njihovo občutljivo in zahtevno uporabo«, ter nebiološkimi barvili za tekstil, ki »zahtevajo manj stroge in zahtevne proizvodne standarde«. Obe vrsti izdelkov sta nosili isto ime, razlika med njima pa nikoli ni bila le vprašanje stopnje. Specifikacija, napisana za bombaž, in specifikacija, napisana za diagnostični reagent, nista zamenljivi, material, izdelan po tekstilni specifikaciji, pa ni bil namenjen zaužitju.

Azure B je najjasnejši primer. Gre za monodemetilirano obliko metilenskega modrila, ima lastno merljivo farmakološko aktivnost in je bil več kot stoletje nenadzorovana sestavina kliničnih pripravkov metilenskega modrila, preden ju je kdo ločil. Ena raziskovalna skupina je ugotovila, da je človeško tkivo, odvzeto ob obdukciji po uporabi metilenskega modrila, vsebovalo 5 do 14 per cent nespremenjenega metilenskega modrila in 86 do 95 per cent Azure B. Ali naj določen pripravek vsebuje Azure B in kakšna naj bo meja, je vprašanje specifikacije, raziskave o Azure B kot nečistoti in presnovku pa se nadaljujejo od tam.

V specifikaciji je tudi praktična posledica. Skladnost z USP je pot do najvišje čistosti, ki jo ponuja trg, ker gre za celovit objavljen preskusni standard in ne za eno samo meritev. Zajema identiteto, vsebnost, organske nečistote, vključno z azurnimi barvili, preostala topila, elementne nečistote, ostanek po žarenju, mikrobiološke meje in bakterijske endotoksine. Certifikat, ki navaja rezultat za težke kovine in ga predstavlja kot skladnost z USP, je navedel le eno postavko s tega seznama.

Blupreme pridobiva svoje metilensko modrilo od farmacevtskega proizvajalca in objavlja celoten certifikat analize, pri čemer preskuša celotno specifikacijo USP in ne le težkih kovin. Vodnik za branje certifikata analize in kaj oznaka USP potrjuje in česa ne pojasnjujeta, kako dokument preveriti glede na navedeno trditev.

Kaj zgodovina upravičuje in česa ne

Razvojna linija je resnična in daljša, kot nakazuje večina strani z izdelki. Metilensko modrilo je bilo leta 1891 uporabljeno za zdravljenje malarije, leta 1899 je bilo opisano kot sedativ pri agitiranih psihozah, njegova stranska veja pa vodi prek kinakrina, klorokina, prometazina in klorpromazina. Ehrlichov članek iz leta 1890, napisan z Arthurjem Leppmannom, je opisoval lajšanje nevralgične in revmatične bolečine, nato pa obravnaval možnost preizkusa barvila pri duševnih boleznih in se odločil, da tega ne bo storil.

Nič od tega ne utemeljuje sodobne uporabe. Rezultat pri malariji iz leta 1891 je temeljil na dveh bolnikih in temperaturnem grafikonu. Dolgotrajna poznanost molekule je razlog za njeno preučevanje, ne rezultat. Zgodovina spojine kot zdravila in sodobna preskušanja pri malariji odgovarjata na drugačna vprašanja od tistih, ki jih je postavljal Ehrlich, končne izide pa je treba presojati po njihovih lastnih merilih.

V zapisu je ena podrobnost, ki bolj kot preteklosti pripada sedanjosti. Ko so raziskovalci v 2000-ih v Burkini Faso izvajali preskušanja metilenskega modrila pri malariji, so se morali potegovati za material farmacevtske kakovosti in poročali, da je cena surovine narasla za približno stokrat, ko je pridobila validacijo GMP. Barvilo je bilo mogoče nadomestiti. Zdravila ne. Razlika, ki jo je Lillie opredelil leta 1969, je ista razlika, ki danes določa, kaj vsebuje steklenička. :::