Metilensko modrilo in mitohondriji: prenos elektronov in dokazi

Predstavljajte si dva preparata drugega ob drugem. Oba vsebujeta možganske mitohondrije, zastrupljene z rotenonom, kemikalijo, ki blokira kompleks I dihalne verige. V enega raziskovalec s pipeto doda mikromolarni odmerek metilenskega modrila. Poraba kisika se delno obnovi. Membranska napetost se delno povrne. Znova se začne sinteza majhne količine ATP. V sosednji kiveti senzor za peroksid razkriva drugo polovico zgodbe: nastajanje vodikovega peroksida se je večkrat povečalo, pri vsakem preizkušenem odmerku in vsakem uporabljenem substratu.

Oba odčitka sta pravilna. Metilensko modrilo je prenašalec elektronov, ki lahko vzdržuje njihov tok mimo poškodovanega odseka dihalne verige, vendar pri tem terja tudi svoj davek v obliki peroksida. Če hkrati upoštevamo obe dejstvi, postane literatura o vplivu metilenskega modrila na mitohondrijsko delovanje razumljiva. Če upoštevamo le eno, se bere kot zgodba o čudežu ali nevarnosti, odvisno od tega, kateri članek smo odprli najprej.

Preprosta razlaga prenašalca

Dihalna veriga je zaporedje predaj. Elektroni vstopajo pri kompleksu I (iz NADH) ali pri kompleksu II in sorodnih flavinskih encimih (iz sukcinata in podobnih donorjev), prehajajo skozi kompleks III do mobilnega prenašalca citokroma c, nato pa skozi kompleks IV do kisika. Vsaka predaja črpa protone čez notranjo membrano, nastali gradient pa poganja sintezo ATP. Če blokiramo katero koli postajo, predhodni del verige obmiruje.

Metilensko modrilo se vključi kot vzporedni kurir. Njegova oksidirana oblika prevzame elektrone od predhodnih prenašalcev in postane brezbarvna reducirana oblika, levkometilensko modrilo, ki nato elektrone preda naprej in se znova obarva modro. Obe obliki sta opisani v razlagi redoks para, širše delovanje pri predajanju elektronov pa v splošni razlagi mehanizma. Odprto ostaja vprašanje, kje se kurir znova vključi v verigo: v vezavnem žepu za kinol v kompleksu III, znanem kot mesto Qo, ali neposredno pri citokromu c. Kateri izhod prevladuje, je odvisno od pogojev, kot podrobno pojasnjuje analiza obvoda kompleksa III.

Kaj so tri raziskave na glodavcih dejansko merile

Vse tri raziskave so uporabile izolirane možganske mitohondrije, torej organele, odstranjene iz celice in suspendirane v natančno opredeljenem pufru. Brez celovitih celic, brez živali, ki bi prejele odmerek, brez človeških udeležencev. Koncentracije se nanašajo na raztopino okoli organelov, ne na peroralni odmerek za človeka. Če ohranimo ta okvir, so številke jasne.

Prva raziskava, izvedena na izoliranih možganskih mitohondrijih morskih prašičkov pri koncentracijah od 100 nanomolov do 2 mikromolov na liter, je v istem preparatu opredelila korist in ceno. V zdravih mitohondrijih je barvilo povečalo porabo kisika v mirovanju, vendar dihanja, spodbujenega z ADP, ni spremenilo, zato se sklopljena tvorba ATP ni izboljšala. Ob blokadi kompleksa I je pri koncentraciji 2 mikromola na liter povečalo sintezo ATP s 46 na 93 nanomolov na minuto na miligram, v primerjavi z normalno hitrostjo blizu 1109. Ob blokadi kompleksa III je isti odmerek povečal tvorbo ATP s približno 46 na 63, v primerjavi z normalno hitrostjo blizu 910. Napetost in privzem kalcija sta se delno obnovila. Blokade kompleksa IV s cianidom ni bilo mogoče obiti, kar koristni izhod elektronov umešča pred delujoči kompleks IV. Vsaka obnovitev delovanja je bila statistično potrjena in majhna: dosegala je enomestne odstotke normalne tvorbe ATP.

Druga raziskava, izvedena na mitohondrijih možganske skorje miši pri koncentraciji okoli 1 mikromola na liter, je potrdila obvod kompleksa I in postavila mejo pri kompleksu III. Rotenon je zmanjšal dihanje s približno 121 na manj kot 2 nanomola kisika na minuto na miligram, barvilo pa ga je povečalo na približno 21, torej na približno šestino normalne vrednosti, medtem ko se je membranska napetost skoraj povsem obnovila. Po blokadi kompleksa III pa se pri koncentracijah od 1 do 5 mikromolov na liter nista obnovila niti dihanje niti napetost, blokada pa je zavrla tudi peroksidni signal, ki ga je povzročalo barvilo. Avtorji so predlagali, da reducirano barvilo oddaja elektrone na mestu Qo kompleksa III: če je to mesto zasedeno, kurir nima kam dostaviti tovora.

Tretja raziskava, izvedena na možganskih mitohondrijih miši, podgan in morskih prašičkov predvsem pri koncentraciji 2 mikromola na liter, je neskladje neposredno preverila in ugotovila, da je blokado kompleksa III mogoče premostiti. Ko je zaviralec mesta Qo miksotiazol zmanjšal bazalno dihanje za 88 odstotkov, je barvilo obnovilo porabo kisika na približno 62 odstotkov hitrosti brez blokade. V neposrednem preizkusu je pri koncentraciji pol mikromola na liter reduciralo eksogeni citokrom c tudi ob blokiranem kompleksu III, kar podpira pot od NADH prek barvila do citokroma c in naprej do kompleksa IV. Toda obnovljeno dihanje se je vedlo nenormalno: dodani ADP je porabo kisika zmanjšal, namesto da bi jo povečal, blokada sinteze ATP pa je dihanje spodbudila. Napetost se je le delno ponovno vzpostavila. Visoka poraba kisika z obrnjeno sklopitvijo ni normalna proizvodnja energije.

Zakaj se laboratoriji ne strinjajo in kaj razjasni neskladje

Razlaga z razlikami med vrstami odpade prva. Tretja skupina je delo ponovila pri treh vrstah glodavcev in pri vseh ugotovila kvalitativno enak obvod, vključno s sevom miši, pri katerem so prej poročali o odsotnosti obvoda. Razlikujejo pa se koncentracija (1 proti 2 mikromoloma na liter), odmerki zaviralcev, pufri, metode izolacije in predvsem primerjano energijsko stanje: obvod je najjasnejši pred dodatkom ADP, prav tam, kjer se pojavi paradoksni odziv na ADP. Pošten prikaz zato kaže dva izhoda, odvisna od pogojev, enega na mestu Qo in drugega pri citokromu c. Kurir dostavi elektrone tja, kamor mu dopuščajo lokalne kemijske razmere.

Davek v obliki peroksida

Ugotovitve o ceni so prav tako dosledne kot ugotovitve o obnovitvi delovanja. V raziskavi na morskih prašičkih je barvilo povečalo sproščanje peroksida v vseh preizkušenih pogojih: v mirovanju, med sintezo ATP in ob kemično okrnjenem delovanju, pri vseh treh substratih. Med sintezo ATP se je nastajanje pri koncentraciji 1 mikromola na liter povečalo s približno 148 na več kot 1500 pikomolov na minuto na miligram, že 100 nanomolov na liter pa je signal povečalo za več kot štirikrat. Barvilo je tudi približno 2.6-krat upočasnilo odstranjevanje peroksida, zato signal odraža hitrejše nastajanje in počasnejše odstranjevanje. Predlagani kemijski mehanizem je neposredna redukcija kisika z reduciranim barvilom brez zaznavnega superoksida, vendar to ostaja razlaga, ne pa dokazan korak.

Raziskava na miših sliko dodatno zaplete na koristen način. Peroksid je z odmerkom strmo naraščal, od izhodiščne vrednosti blizu 76 do skoraj 2000 pikomolov na minuto na miligram pri koncentraciji 2 mikromola na liter, vendar je blokada kompleksa III zavrla delež, ki ga je povzročalo barvilo. Če bi peroksid nastajal le zaradi reakcije reduciranega barvila s kisikom, blokada verige ne bi smela imeti tako velikega vpliva. Ker ga ima, pri procesu sodeluje tudi veriga. Pregled antioksidativnega in prooksidativnega delovanja to dvojnost umešča v širši kontekst, analiza kisika v primerjavi z ATP pa pojasnjuje, zakaj same številke o kisiku nikoli ne zadoščajo za presojo trditve o energiji.

Obnovitev delovanja ni popravilo

Vprašanje, ki ga je treba opustiti, je »ali metilensko modrilo popravi mitohondrije«. Popravilo bi pomenilo trajno odpravo okvare: obnovljene komplekse, sklopitev, ki se ohrani po odstranitvi učinkovine, obnovitev delovanja v celovitih celicah in nato izboljšano delovanje v živem organizmu. Nobeden od treh člankov tega ne pokaže. Pokažejo akutno preusmerjanje v sveže izoliranih organelih med umetno kemično blokado, pri čemer tvorba ATP dosega le majhne deleže normalnih vrednosti, sklopitev pa je včasih naravnost nenavadna. Rotenon in antimicin sta laboratorijski orodji, ne modela staranja ali človeške mitohondrijske bolezni, in nič od tega ne pomeni več energije za zdravega človeka. To je ločeno vprašanje dokazov z lastno literaturo o raziskavah pri ljudeh.

Tri omejitve ohranjajo vsak sklep o biohekingu pošten. Prvič, koncentracija v raztopini ni odmerek: od 0.1 do 2 mikromolov na liter okoli izoliranih organelov ne pove ničesar o tem, katera peroralno zaužita količina ustvari takšno prosto koncentracijo ob mitohondriju v človeških možganih, zlasti ker se barvilo kopiči ali sprošča glede na samo membransko napetost. Drugič, kisik ni energija: barvilo lahko poveča porabo kisika tako z redoks kroženjem in uhajanjem elektronov kot s produktivno fosforilacijo, zato respirometrija brez meritev ATP in napetosti ne upravičuje trditve o energiji. Tretjič, korist in breme sodita v isti stavek: vsaka trditev o obnovljeni napetosti ali ATP, ki izpusti sočasno povečanje peroksida, napačno predstavi poskus. Povezana pojasnila vključujejo redoks ravnovesje NAD, obliko odziva na odmerek in vodnik po meritvah.

Še praktična opomba: prenašanje elektronov je lastnost točno določene molekule. Tudi demetilirane sorodne spojine, kot je Azure B, so redoks aktivne, vendar se vedejo drugače, zato je delno razgrajena raztopina drugačen poskus kot nespremenjeno barvilo. To je eden od razlogov, da zahtevamo celotno farmakopejsko specifikacijo in objavljen dokument o seriji, ne zgolj preverjanja kovin. Kemija, ki jo poganja svetloba, dodaja podobno opozorilo za uporabo ob osvetlitvi; obravnavana je v članku o kombinacijah z rdečo svetlobo.

Ozko opredeljena trditev vzdrži vse to in jo je vredno ohraniti: metilensko modrilo lahko v poškodovanih izoliranih mitohondrijih pod določenimi pogoji deluje kot kurir za elektrone in delno ohranja njihov tok za ceno povečanja peroksida. Vse, kar presega to — energija, dolgoživost, popravilo — čaka na dokaze, za pridobivanje katerih te raziskave nikoli niso bile zasnovane.