Identifikácia metylénovej modrej v laboratóriu: infračervené spektrá a doplnkové metódy

Predstavte si, že tri laboratóriá dostanú rovnaký modrý prášok. Prvé zaznamená infračervené spektrum a vyhlási, že ide o metylénovú modrú. Druhé vykoná chromatografiu a uvedie 0.4% Azure B. Tretie pomocou röntgenovej difrakcie na kryštáloch určí hydrátovú formu. Všetky tri majú pravdu a ani jedno neodpovedalo na zvyšné dve otázky. Zmätok vzniká vtedy, keď sa jeden výsledok považuje za odpoveď na všetky tri.

Tento článok tieto otázky oddeľuje. Infračervená identifikácia potvrdzuje molekulovú identitu porovnaním s referenčným štandardom. Chromatografia určuje zloženie. Difrakcia určuje formu v tuhom stave. Vyhovujúca zhoda pri skúške totožnosti nie je certifikátom čistoty.

Infračervená identifikácia dobre odpovedá na jednu otázku

Liekopisná skúška totožnosti metylénovej modrej je porovnaním spektra so štandardom, nie kontrolným zoznamom píkov. V náhľade monografie USP pre metylénovú modrú sa pri skúške totožnosti A uvádza infračervená spektroskopia s optikou ATR alebo s tabletou bromidu draselného. Spektrum vzorky musí zodpovedať spektru referenčného štandardu USP, pričom vzorka aj štandard musia byť pripravené a zaznamenané za rovnocenných podmienok. Výsledok neurčuje žiadny pevný zoznam diagnostických vlnočtov. Rozhoduje prekrytie spektier.

Táto voľba odráža správanie FTIR spektier metylénovej modrej. Najvýraznejšie znaky sa nachádzajú v oblasti odtlačkov prstov. Priradenia v literatúre dôsledne umiestňujú hlavný pás konjugovaných kruhov približne na 1590 až 1600 cm-1, kde sa vzájomne spriahajú valenčné vibrácie aromatických väzieb uhlík–uhlík a uhlík–dusík. Ďalšie pásy pri približne 1490 a 1390 cm-1 majú charakter vibrácií kruhu, väzieb uhlík–dusík a deformačných vibrácií väzieb uhlík–vodík. Pásy pri približne 1355 a 1330 cm-1 zahŕňajú väzby uhlík–dusík dimetylaminoskupín a deformácie metylových skupín. Znaky pri približne 1225 až 1250 cm-1 patria heterocyklickej kostre, zatiaľ čo pásy pri približne 1170 až 1130 a 1066 cm-1 majú charakter vibrácií väzieb uhlík–síra; deformačné vibrácie aromatických väzieb C-H sa nachádzajú pri približne 880 cm-1. Valenčné vibrácie sa objavujú pri vyšších vlnočtoch: aromatické C-H pri približne 3040 cm-1 a C-H N-metylových skupín približne medzi 2900 a 3000 cm-1. Publikované priradenia sa v detailoch líšia, pretože fenotiazíniová kostra vibruje ako spriahnutý systém. Každú jednotlivú tabuľku priradení preto vnímajte ako publikovanú interpretáciu, nie ako jedinú možnú.

Pozornosť si zaslúžia dva vplyvy prípravy, pretože menia IR spektrá metylénovej modrej bez toho, aby sa zmenilo samotné farbivo. Po prvé, hydratovaný materiál vykazuje široký pás O-H približne pri 3300 až 3500 cm-1 a deformačné vibrácie vody pri približne 1630 až 1640 cm-1, pričom rôzne hydrátové formy merateľne posúvajú pásy v oblasti odtlačkov prstov. Po druhé, matrica tablety KBr je hygroskopická: absorbovaná vlhkosť vytvára pásy presne v týchto oblastiach vody a môže sa mylne považovať za hydrátovú vodu zo vzorky. Meranie pomocou ATR sa vyhýba matrici KBr, no intenzity pri ATR sa menia podľa hĺbky prieniku závislej od vlnočtu, takže spektrum ATR a transmisné spektrum rovnakého prášku nemožno priamo prekryť. Z liekopisnej požiadavky vyplýva praktické pravidlo: porovnávajte vzorku a referenciu zaznamenané rovnakou technikou a zdokumentujte, ktorá technika sa použila. Chemické základy katiónu, soli a hydrátov, ktoré stoja za týmito spektrami, nájdete v prehľade štruktúry a vlastností metylénovej modrej.

Tabuľka výberu analytickej metódy

Táto tabuľka slúži ako pomôcka pri výbere. Čítaním jednotlivých riadkov zistíte, na ktorú otázku metóda odpovedá, čo potvrdzuje vyhovujúci výsledok a čo zostáva nepreukázané.

Prečo zhoda infračervených spektier nie je certifikátom čistoty

Zhoda pri skúške totožnosti vylučuje nesprávne farbivo. Neposkytuje však úplný prehľad zložiek vzorky. Najdôležitejšie sú tri obmedzenia.

Po prvé, blízko príbuzné látky vyzerajú v infračervenej oblasti podobne. Azure B sa od metylénovej modrej líši jedinou metylovou skupinou, takže jeho spektrum sa veľmi podobá spektru metylénovej modrej. Zmes obsahujúca niekoľko percent Azure B sa stále dobre prekrýva s referenčným spektrom metylénovej modrej. Detekcia tejto nečistoty je úlohou chromatografie, ktorej sa venuje sprievodca nečistotami metylénovej modrej a skúšobnými metódami.

Po druhé, infračervená spektroskopia je technika skúmajúca vzorku ako celok, s obmedzenou citlivosťou na minoritné zložky. Malé množstvá príbuzných farbív, zvyškových rozpúšťadiel alebo anorganických zvyškov sa skrývajú pod hlavnými pásmi. Neprítomnosť ďalších píkov je len slabým dôkazom neprítomnosti nečistôt.

Po tretie, referenčný štandard určuje celé porovnanie. Degradovaný štandard, štandard so spektrálnymi posunmi v dôsledku hydratácie alebo štandard, s ktorým sa nesprávne zaobchádzalo, mení kritériá hodnotenia. To isté platí pre nesúlad použitých techník, napríklad keď sa spektrum vzorky merané pomocou ATR posudzuje voči referencii v KBr. Pri každom výsledku zaznamenajte šaržu štandardu, techniku a prípravu.

Zmesi prinášajú ešte jedno upozornenie. Spektrum, ktoré sa prevažne zhoduje, ale vykazuje ramená pásov alebo anomálie intenzity, nie je vyhovujúcim výsledkom s poznámkami pod čiarou. Je to signál, že pred identifikáciou treba zložky vzorky separovať.

Doplnkové metódy v praxi

HPLC metylénovej modrej poskytuje odpoveď na otázku zloženia, ktorú infračervená spektroskopia poskytnúť nemôže. Súčasná liekopisná metóda používa kolónu fenylového typu s gradientom voda–acetonitril obsahujúcim kyselinu trifluóroctovú a detekciu pri 246 nm, nie vo viditeľnej oblasti. Identita sa určuje podľa zhody retenčného času s referenčným štandardom; rovnaké porovnanie slúži aj na stanovenie obsahu. Skúška organických nečistôt priraďuje Azure B pomocou jeho vlastného referenčného materiálu pri relatívnej retencii približne 0.8 voči metylénovej modrej pri 1.0 a vyžaduje vysoké rozlíšenie medzi týmito dvoma píkmi. Všimnite si výber vlnovej dĺžky: demetylačná séria absorbuje postupne viac smerom k červenej oblasti, od tionínu pri približne 600 nm cez Azure C, Azure A a Azure B až po metylénovú modrú pri približne 670 nm. Detektor nastavený na pevnú vlnovú dĺžku približne 660 nm preto poskytuje v rámci série nerovnakú odozvu a podhodnocuje niektoré homológy. Úplné profilovanie celej série, ak je potrebné, patrí metóde C18 LC-MS/MS s kvalifikovanými štandardmi pre každý analyt.

Prášková difrakcia odpovedá na otázku formy v tuhom stave, ktorú obe vyššie uvedené metódy buď zničia, alebo ignorujú: rozpustenie prášku na chromatografiu vymaže informácie o kryštáloch a molekulové vibrácie vypovedajú o väzbách, nie o usporiadaní na veľké vzdialenosti. Difrakčné obrazce rozlišujú hydrátové fázy a kryštalinitu a metylénová modrá si takéto skúmanie vyžaduje viac než väčšina materiálov. Rager a kolegovia pri výskume tuhého stavu identifikovali päť odlišných hydrátových štruktúr vrátane pentahydrátu, dvoch dihydrátov, monohydrátu a intermediárneho hydrátu; medzi charakterizovanými formami nenašli žiadny skutočný trihydrát. Laboratórna manipulácia je tu dôležitá: vlhkosť a teplota menia stabilitu hydrátov a intenzívne mletie môže zmeniť fázu alebo znížiť kryštalinitu. Preto kontrolujte a dokumentujte relatívnu vlhkosť aj teplotu a mletie obmedzte na minimum. Označovanie hydrátov a jeho vplyv na naváženú hmotnosť sa podrobnejšie rozoberajú v článku hydrátové formy metylénovej modrej a ich označovanie.

UV-Vis absorpcia má podpornú úlohu. Známe maximá potvrdzujú očakávané správanie roztoku a umožňujú stanovovať koncentráciu. Modrý roztok absorbujúci pri očakávanej vlnovej dĺžke však iba zodpovedá metylénovej modrej bez toho, aby ju preukázal, pretože príbuzné farbivá absorbujú v blízkej oblasti.

Na čo sa pýtať pred nákupom

Premietnite tieto rozdiely do otázok pri nákupe. Pýtajte sa, ktorá šarža bola testovaná, ktorá technika potvrdila identitu, či sa pri HPLC skúške nečistôt použil referenčný materiál Azure B a či bola hydrátová forma charakterizovaná alebo iba predpokladaná. Predovšetkým sa pýtajte, či certifikát pokrýva úplnú špecifikáciu alebo iba vybrané skúšky. Mnohí predajcovia, ktorí deklarujú súlad s liekopisom, testujú iba ťažké kovy, čím zostávajú nezodpovedané otázky totožnosti, obsahu, organických nečistôt, rozpúšťadiel a mikrobiálnej kvality.

Blupreme v spolupráci s farmaceutickým výrobcom metylénovej modrej testuje úplnú špecifikáciu USP, ktorá zahŕňa totožnosť, čistotu, organické nečistoty, zvyškové rozpúšťadlá, elementárne nečistoty, zvyšok po žíhaní, mikrobiálne limity a bakteriálne endotoxíny. Verejný certifikát analýzy pre každú šaržu je zverejnený na stránke testovania kvality Blupreme, takže základ stanovenia obsahu a výsledky nečistôt možno čítať priamo namiesto ich odvodzovania. Aj pri výsledkoch blízkych 100% treba uviesť základ výpočtu, ako vysvetľuje sprievodca stanoveným obsahom nad 100 percent. Zhoda pri skúške totožnosti skúmanie otvára. Úplná dokumentácia ho uzatvára.