Historia błękitu metylenowego: od barwnika do leku i badań

Błękit metylenowy trafił do pacjenta, zanim trafił do apteki.

Raport Paula Guttmanna i Paula Ehrlicha z 1891 roku dotyczący zastosowania tego barwnika w malarii zawiera dwa wykresy temperatury. Drugi obejmuje okres od 13 lipca do 5 sierpnia, a leczenie zapisano dzień po dniu na marginesie. Wpisy z 18 i 19 lipca brzmią „1 × 0,05 Methylenblau”. W kolejnych dniach odnotowano pięć i siedem dawek tej samej ilości, a do 22 lipca w zapisie pojawiła się również niewielka ilość chininy. Linia gorączki, która w pierwszej połowie wykresu waha się między 37 °C a 39.5 °C, wypłaszcza się po pojawieniu się barwnika i przez pozostałe trzy tygodnie utrzymuje się między około 36 °C a 37.5 °C.

Pacjent był jednym z dwóch mężczyzn opisanych w pracy jako służący domowy i marynarz. Związek, który otrzymali, przez piętnaście lat był komercyjnym barwnikiem tekstylnym, a ci dwaj mężczyźni należą do pierwszych odnotowanych osób leczonych w pełni syntetycznym lekiem ukierunkowanym na konkretny organizm.

Najpierw był barwnik

Pierwszy syntetyczny barwnik, który odniósł sukces komercyjny, stworzył William Henry Perkin w 1856 roku. Perkin miał osiemnaście lat, pracował podczas przerwy wielkanocnej w domowym laboratorium i próbował zsyntetyzować chininę. Zamiast tego otrzymał czarną pozostałość, rozpuścił ją i odkrył barwnik, który znakomicie utrwalał się na jedwabiu. Opatentował go w sierpniu 1856 roku, a pod koniec 1857 roku prowadził już fabrykę zaopatrującą londyńską farbiarnię jedwabiu.

W 1875 roku Adolf von Baeyer zsyntetyzował czerwony barwnik i nazwał go eozyną, od Eos, greckiego słowa oznaczającego świt. W 1876 roku Heinrich Caro, będący wówczas dyrektorem laboratorium Badische Anilin- und Soda-Fabrik, opracował wraz z Baeyerem błękit metylenowy jako barwnik anilinowy do bawełny. Jego struktury chemicznej nie ustalono ostatecznie aż do około dziewięciu lat później.

To pochodzenie nadal widać w nazewnictwie tej substancji. „Błękit metylenowy” to nazwa handlowa pochodząca z katalogu barwników, a nie opis chemiczny. Związek, do którego się odnosi, to chlorek metylotioniniowy, a różnice między nazwą, solą i jej hydratami zaczynają mieć znaczenie, gdy tylko ktoś waży materiał albo czyta specyfikację.

Barwienie było pomostem

Droga z farbiarni do szpitala prowadziła przez mikroskop i zaczęła się jeszcze przed powstaniem błękitu metylenowego. Wilhelm Erb jako pierwszy zastosował syntetyczny barwnik do krwi, używając w 1865 roku kwasu pikrynowego, i zaobserwował siateczkowaty wzór wewnątrz niektórych krwinek czerwonych.

Rozprawa doktorska Paula Ehrlicha z 1878 roku porównywała barwienie histologiczne z barwieniem tkanin i dowodziła, że oba procesy są reakcjami chemicznymi. Pracując pod kierunkiem Roberta Kocha nad prątkiem gruźlicy, Ehrlich podzielił barwniki anilinowe na klasy kwasowe i zasadowe oraz ustalił, że każda z tych klas barwi inne części komórki. W 1880 roku zmieszał obie klasy: nasycony roztwór błękitu metylenowego wlewał do kwaśnej fuksyny, aż ciecz nad osadem stała się klarowna. Otrzymany preparat, który nazwał neutralen Farbkörper, czyli barwnikiem obojętnym, dawał trzy kolory zamiast jednego, ujawniał niewidoczne wcześniej ziarnistości w komórkach wielojądrzastych i umożliwił wykonanie pierwszego rozmazu różnicowego leukocytów. Ponieważ ziarnistości te wiązały oba składniki mieszaniny, Ehrlich ukuł termin neutrofil dla komórek, które je zawierały.

Dwa lata później Koch użył błękitu metylenowego do wykrywania prątka gruźlicy, a w 1883 roku Ehrlich udoskonalił tę metodę. W 1886 roku opublikował obserwację innego rodzaju: wstrzykiwał barwnik żywym zwierzętom i porównywał stopień jego wychwytu przez poszczególne narządy, dochodząc do wniosku, że wykazuje on wyraźne powinowactwo do mózgu i tkanki nerwowej. Przypisał to powinowactwo cyklowi utleniania i redukcji barwnika, który zaobserwował rok wcześniej. Ten sam cykl powoduje, że roztwór błękitu metylenowego traci kolor po zużyciu tlenu i odzyskuje go po ponownym kontakcie z powietrzem. Eksperymenty, w których po raz pierwszy zmierzono konsekwencje tego cyklu, przeprowadzono w późniejszej dekadzie, a sam mechanizm jest odrębnym tematem od historii związku.

Pasożyt i fioletowe jądro

Alphonse Laveran odkrył pasożyta wywołującego malarię w 1880 roku, badając świeżą, niebarwioną krew. Rutynowe uwidocznienie go w wysuszonym rozmazie wymagało barwnika, a ówczesne metody dawały jedynie kolor czerwony i niebieski.

W 1888 roku polski patolog Czesław Cheçinski zastąpił kwaśną fuksynę eozyną, tworząc mieszaninę błękitu metylenowego i eozyny. Przypadek, na podstawie którego opracował swoją metodę, dotyczył żołnierza zmarłego na malarię 30 września 1887 roku. W rozmazach krwi Cheçinski dostrzegł niebieskie formy przypominające stokrotki, obecnie rozpoznawane jako Plasmodium malariae, oraz formy sierpowate, obecnie rozpoznawane jako gametocyty Plasmodium falciparum. Wynik ten zakończył jednocześnie dwa konkurencyjne wyjaśnienia choroby: teorię miazmatyczną oraz twierdzenie Edwina Klebsa i Corrada Tommasiego-Crudeliego, że malarię wywołuje bakteria.

Pasożyt był widoczny. Jego jądro nie, co pozostawiało otwarte pytanie o jego naturę. Ernst Malachowski, lekarz z Breslau, rozwiązał ten problem najpierw przypadkiem, a następnie celowo. W 1889 roku zauważył różnicowe wybarwienie jądra zarodźca w jednym preparacie, ale nie potrafił odtworzyć efektu. Zakwaszenie błękitu metylenowego nie pomogło. Alkalizacja boraksem wywoływała efekt za każdym razem. Publicznie zademonstrował tę technikę 15 czerwca 1890 roku i opublikował ją w tym samym roku, a pełniejszą metodę przedstawił w sierpniu 1891 roku.

Dmitri Romanowsky opublikował własną wersję we wrześniu 1891 roku. Najlepsze rezultaty uzyskał ze starej, zaniedbanej i spleśniałej butelki roztworu błękitu metylenowego mającego ponad dwa miesiące. Opis Malachowskiego przedstawiał celową metodę i, jak sam pisał, łatwą do odtworzenia; metoda Romanowsky'ego była ślepą uliczką, która zadziałała jeden raz. Mimo to eponim przypadł Romanowsky'emu, a spór o to, kto uzyskał fiolet umożliwiający uwidocznienie jądra to osobna historia oparta na własnym zestawie dokumentów.

Rycina: drugi wykres temperatury z raportu Guttmanna i Ehrlicha z 1891 roku. Górny panel obejmuje okres od 13 do 24 lipca, a dolny od 25 lipca do 5 sierpnia; wpisy na marginesie podają zastosowane dawki, a przez ostatnie trzy tygodnie zapisu temperatura utrzymuje się blisko normy. Reprodukcja z raportu zeskanowanego na potrzeby publikacji Kraftsa, Hempelmanna i Skórskiej-Stani, Parasitology Research 111:1–6 (2012), PMID 22411634.

Okazało się, że dojrzewanie polega na demetylacji

Nikt działający w latach 1890. nie wiedział, co „dojrzewanie” robi z błękitem metylenowym. Odpowiedź przyszła z chemii przemysłowej. Heinrich August Bernthsen zsyntetyzował w 1883 roku związek macierzysty, fenotiazynę, w 1885 roku ustalił, że błękit metylenowy należy do tej rodziny, a w tym samym okresie wykazał, że warunki zasadowe usuwają z barwnika grupy metylowe, tworząc związki nazywane dziś azurami.

Bernard Nocht wyizolował aktywną frakcję w 1898 i 1899 roku i mógł nazwać ją jedynie Rot aus Methylenblau, czyli czerwienią z błękitu metylenowego. Michaelis zidentyfikował ją w 1901 roku jako azure I. Jenner wprowadził w 1899 roku bezwodny metanol jako rozpuszczalnik osadu barwnika, eliminując konieczność utrwalania rozmazów krwi przez ogrzewanie; Leishman i Reuter połączyli oba udoskonalenia; Wright opublikował uproszczoną metodę w 1902 roku. Wkład Giemsy, również z 1902 roku, polegał na odejściu od losowo dojrzewającego roztworu i zastosowaniu zamiast niego odmierzonych ilości znanych barwników. Następnie odmówił publikacji sposobu wytwarzania czystego azuru metylenowego i sprzedał metodę laboratorium dr. Grüblera, które wprowadziło produkt na rynek jako azure I i twierdziło, że wyłącznie jego wersja jest autentycznym barwnikiem Giemsy.

Dwie wojny światowe przypadkowo dokończyły ten proces. Gdy niemieckie barwniki stały się niedostępne, Lillie, Roe i Wilcox pracowali nad amerykańskimi zamiennikami i stwierdzili, że najlepsze wybarwienie daje połączenie trzech rozdzielonych składników: czystego błękitu metylenowego, produktu jego rozpadu azure B oraz eozyny. Te trzy składniki pozostają głównymi elementami barwnika używanego dziś do diagnostyki malarii, pod nazwą łączącą obecnie Malachowskiego, Wrighta i Giemsę.

Rycina: formy pierścieniowate Plasmodium falciparum w ludzkich krwinkach czerwonych, wybarwione metodą typu Romanowsky'ego. Fioletowa struktura wewnątrz pierścienia to chromatyna, którą błękit metylenowy Malachowskiego potraktowany boraksem po raz pierwszy uczynił widoczną. Obraz autorstwa Ernsta Hempelmanna, udostępniony w domenie publicznej.

Jedna nazwa, kilka materiałów

Lata potrzebne do rozdzielenia tych składników pozostawiły problem, który przetrwał dłużej niż sama niejasność chemiczna. Ralph Lillie w 1969 roku wyznaczył granicę między barwnikami biologicznymi, „produkowanymi według rygorystycznych specyfikacji odpowiadających ich delikatnym i wymagającym zastosowaniom”, a barwnikami niebiologicznymi przeznaczonymi do barwienia tekstyliów, które „wymagają mniej rygorystycznych i mniej wymagających standardów produkcyjnych”. Oba rodzaje produktów nosiły tę samą nazwę, a różnica między nimi nigdy nie była jedynie różnicą stopnia. Specyfikacja opracowana dla bawełny i specyfikacja opracowana dla odczynnika diagnostycznego nie są zamienne, a materiał wyprodukowany według tej pierwszej nie był przeznaczony do spożycia.

Azure B jest najczytelniejszym przykładem. Jest monodemetylowaną formą błękitu metylenowego, wykazuje własną mierzalną aktywność farmakologiczną i przez ponad sto lat występował jako niekontrolowany składnik klinicznych preparatów błękitu metylenowego, zanim oba związki rozdzielono. Jedna grupa badawcza stwierdziła, że tkanka ludzka pobrana podczas sekcji zwłok po podaniu błękitu metylenowego zawierała od 5 do 14 procent niezmienionego błękitu metylenowego i od 86 do 95 procent azure B. To, czy dany preparat powinien zawierać azure B i w jakiej granicy, jest kwestią specyfikacji, a badania nad azure B jako zanieczyszczeniem i metabolitem rozwijają ten temat dalej.

Specyfikacja jest również miejscem, w którym pojawiają się praktyczne konsekwencje. Zgodność z USP jest drogą do najwyższej czystości oferowanej przez rynek, ponieważ stanowi kompletny, opublikowany standard badań, a nie pojedynczy pomiar. Obejmuje identyfikację, oznaczenie zawartości, zanieczyszczenia organiczne, w tym barwniki azurowe, rozpuszczalniki resztkowe, zanieczyszczenia pierwiastkowe, pozostałość po prażeniu, limity mikrobiologiczne i endotoksyny bakteryjne. Certyfikat, który podaje wynik badania metali ciężkich i nazywa go zgodnością z USP, przedstawia tylko jedną pozycję z tej listy.

Blupreme pozyskuje błękit metylenowy od producenta farmaceutycznego i publikuje pełny certyfikat analizy, badając zgodność z całą specyfikacją USP, a nie wyłącznie zawartość metali ciężkich. Przewodnik po czytaniu certyfikatu analizy oraz wyjaśnienie, co oznaczenie USP potwierdza, a czego nie pokazują, jak porównać dokument z deklaracją.

Na co pozwala historia, a na co nie

Ta historia jest rzeczywista i dłuższa, niż sugeruje większość stron produktowych. Błękit metylenowy zastosowano w leczeniu malarii w 1891 roku, w 1899 roku opisano go jako środek uspokajający w psychozie z pobudzeniem, a jego łańcuch boczny prowadzi przez kinakrynę, chlorochinę, prometazynę i chlorpromazynę. Praca Ehrlicha z 1890 roku, napisana wspólnie z Arthurem Leppmannem, opisywała łagodzenie bólu neuralgicznego i reumatycznego, a następnie rozważała i odrzucała możliwość testowania barwnika w chorobach psychicznych.

Żaden z tych faktów nie ustanawia współczesnego zastosowania. Wynik dotyczący malarii z 1891 roku opierał się na dwóch pacjentach i wykresie temperatury. Długa historia znajomości cząsteczki jest powodem, by ją badać, a nie wynikiem badania. Historia związku jako leku oraz współczesne badania kliniczne dotyczące malarii odpowiadają na inne pytania niż te, które stawiał Ehrlich, a ich punkty końcowe należy oceniać w ich własnym kontekście.

W zapisie historycznym znajduje się jeden szczegół, który należy bardziej do teraźniejszości niż do przeszłości. Gdy w latach 2000. badacze prowadzili w Burkina Faso badania kliniczne błękitu metylenowego w malarii, musieli konkurować o materiał klasy farmaceutycznej i donosili, że cena surowca wzrosła około stukrotnie po uzyskaniu walidacji GMP. Barwnik można było zastąpić. Leku nie. Rozróżnienie, które Lillie sformułował w 1969 roku, jest tym samym rozróżnieniem, które dziś decyduje o tym, co znajduje się w butelce.